本文關(guān)鍵詞：自噬對張力誘導(dǎo)終板軟骨細(xì)胞鈣化的影響研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:通過力學(xué)誘導(dǎo)大鼠腰椎的終板軟骨細(xì)胞鈣化，探討在間斷周期性牽張力體外條件下，自噬在終板軟骨細(xì)胞鈣化過程中的變化及意義。 方法:無菌操作臺下，將大鼠腰椎的軟骨終板分離取出，再通過Ⅱ型膠原酶和胰蛋白酶酶消化法及自然傳代法來提取和培養(yǎng)終板軟骨原代細(xì)胞，將第1代的終板軟骨細(xì)胞均勻種植在表面鋪有Ⅰ型膠原的BioFlexTM加力板上，待細(xì)胞貼壁并增殖達(dá)板面的80%～90%融合度，對加力組中終板軟骨細(xì)胞加載頻率為0.5Hz正弦波形，細(xì)胞牽拉形變幅度為10%的間歇循環(huán)張力（ICMT），每天均加力4小時，持續(xù)加力20天后觀察；在加載張力的基礎(chǔ)上，對加力加藥組添加雷帕霉素（Rapamycin）濃度為1umol/L聯(lián)合培養(yǎng)；對照組的終板軟骨細(xì)胞則不加載ICMT刺激。通過LIVE/DEADò染色檢測終板軟骨細(xì)胞活性及存活率，采用茜素紅染色和堿性磷酸酶染色檢測終板軟骨細(xì)胞鈣化程度，通過MDC特異性染色觀察細(xì)胞的自噬小泡，運(yùn)用RealtimeRT-PCR和Western blotting檢測軟骨相關(guān)基因以及自噬相關(guān)基因的表達(dá)變化；運(yùn)用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光標(biāo)記的LC3基因的表達(dá)。 結(jié)果:LIVE/DEADò染色結(jié)果表明，對照組、加力組和加力加藥組中終板軟骨細(xì)胞的活力及粘附力無明顯差異。Realtime RT-PCR和Western blotting的檢測結(jié)果顯示，在ICMT刺激下，，終板軟骨細(xì)胞中自噬相關(guān)基因的表達(dá)水平出現(xiàn)明顯下調(diào)。堿性磷酸酶染色和茜素紅染色的實驗結(jié)果表明：同對照組相比，添加雷帕霉素的加力加藥組和加力組中終板軟骨細(xì)胞在ICMT誘導(dǎo)下，出現(xiàn)明顯的鈣化結(jié)節(jié)；且加力加藥組中終板軟骨細(xì)胞的鈣化程度明顯低于加力組。Realtime RT-PCR的結(jié)果顯示加力加藥組和加力組的終板軟骨細(xì)胞中軟骨相關(guān)基因的表達(dá)水平明顯低于對照組，且加力加藥組細(xì)胞中軟骨相關(guān)基因的表達(dá)水平高于加力組。 結(jié)論:本課題研究表明ICMT誘導(dǎo)終板軟骨細(xì)胞鈣化及抑制自噬的表達(dá)水平，而通過雷帕霉素上調(diào)自噬水平可以部分抑制細(xì)胞的鈣化現(xiàn)象，我們推測自噬作為一種宿主保護(hù)機(jī)制，可能與張力誘導(dǎo)的終板軟骨退變及椎間盤退變過程有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：間斷周期性牽張力 鈣化 終板軟骨細(xì)胞 自噬
【學(xué)位授予單位】：皖南醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R363
【目錄】：

• 中英文縮略詞對照表5-9
• 摘要9-11
• Abstract11-13
• 前言13-16
• 研究內(nèi)容與方法16-31
• 1. 研究內(nèi)容16-17
• 1.1 大鼠終板軟骨細(xì)胞的分離與培養(yǎng)16
• 1.2 觀察對照組和加力組的終板軟骨細(xì)胞表型的變化16
• 1.3 觀察張力誘導(dǎo)后，終板軟骨細(xì)胞自噬標(biāo)志性基因的表達(dá)變化16
• 1.4 觀察雷帕霉素對終板軟骨細(xì)胞退變中自噬水平的變化及作用16-17
• 1.5 觀察自噬在張力誘導(dǎo)終板軟骨細(xì)胞退變過中的作用17
• 2. 材料17-19
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)試劑和儀器17-18
• 2.2 力學(xué)刺激裝置18
• 2.3 染色相關(guān)試劑18
• 2.4 RNA 提取，Realtime-PCR 試劑和儀器18-19
• 2.5 Western-blot 試劑和儀器19
• 3.方法19-29
• 3.1 大鼠腰椎原代終板軟骨細(xì)胞的分離與培養(yǎng)19-20
• 3.2 細(xì)胞傳代與分組20
• 3.3 細(xì)胞凍存與復(fù)蘇20-21
• 3.4 細(xì)胞粘附力及活力檢測21-22
• 3.5 鈣化結(jié)節(jié)檢測22-23
• 3.6 實時熒光定量 PCR 法測定基因 mRNA 的表達(dá)變化23-25
• 3.7 Western-blotting 法測定蛋白的表達(dá)25-28
• 3.8 MDC 染色步驟28
• 3.9 激光共聚焦檢測細(xì)胞中 LC3 基因蛋白表達(dá)28-29
• 3.10 誘導(dǎo)實驗29
• 4. 統(tǒng)計學(xué)方法29-30
• 5. 附：技術(shù)路線圖30-31
• 結(jié)果31-39
• 討論39-45
• 結(jié)論45-46
• 參考文獻(xiàn)46-53
• 附錄53-56
• 綜述56-66
• 參考文獻(xiàn)61-66
• 作者簡介及讀研期間主要科研成果66-67
• 致謝67-68

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 梁巧青;馮震博;;自噬基因Beclin1的研究現(xiàn)狀[J];當(dāng)代醫(yī)學(xué);2010年09期

2 李殿威;周強(qiáng);郭平;宋磊;劉涌;;壓應(yīng)力對組織工程軟骨細(xì)胞增殖的影響[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2010年11期

3 張小海;徐宏光;吳天亮;;椎間盤退變與生物力學(xué)[J];國際骨科學(xué)雜志;2010年03期

4 賈瑞平;徐宏光;張小海;;Wnt信號通路對軟骨細(xì)胞影響研究進(jìn)展[J];國際骨科學(xué)雜志;2010年04期

5 程加峰;徐宏光;;蛋白激酶C對軟骨影響的研究進(jìn)展[J];國際骨科學(xué)雜志;2010年05期

6 宋俊興;徐宏光;賈瑞平;;結(jié)締組織生長因子與軟骨修復(fù)研究進(jìn)展[J];國際骨科學(xué)雜志;2011年04期

7 章平治;徐宏光;宋俊興;;自噬與軟骨及其損傷相關(guān)性[J];國際骨科學(xué)雜志;2012年02期

8 宋俊興;徐宏光;;椎間盤退變體外模型研究進(jìn)展[J];國際骨科學(xué)雜志;2012年02期

9 俞云飛;徐宏光;宋俊興;;力學(xué)刺激對軟骨細(xì)胞影響研究進(jìn)展[J];國際骨科學(xué)雜志;2012年05期

10 馬克學(xué);席興字;;細(xì)胞自噬的作用機(jī)制及功能[J];生物學(xué)教學(xué);2011年05期

  本文關(guān)鍵詞：自噬對張力誘導(dǎo)終板軟骨細(xì)胞鈣化的影響研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：439056