本文關鍵詞：自噬對張力誘導終板軟骨細胞鈣化的影響研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:通過力學誘導大鼠腰椎的終板軟骨細胞鈣化，探討在間斷周期性牽張力體外條件下，自噬在終板軟骨細胞鈣化過程中的變化及意義。 方法:無菌操作臺下，將大鼠腰椎的軟骨終板分離取出，再通過Ⅱ型膠原酶和胰蛋白酶酶消化法及自然傳代法來提取和培養(yǎng)終板軟骨原代細胞，將第1代的終板軟骨細胞均勻種植在表面鋪有Ⅰ型膠原的BioFlexTM加力板上，待細胞貼壁并增殖達板面的80%～90%融合度，對加力組中終板軟骨細胞加載頻率為0.5Hz正弦波形，細胞牽拉形變幅度為10%的間歇循環(huán)張力（ICMT），每天均加力4小時，持續(xù)加力20天后觀察；在加載張力的基礎上，對加力加藥組添加雷帕霉素（Rapamycin）濃度為1umol/L聯(lián)合培養(yǎng)；對照組的終板軟骨細胞則不加載ICMT刺激。通過LIVE/DEADò染色檢測終板軟骨細胞活性及存活率，采用茜素紅染色和堿性磷酸酶染色檢測終板軟骨細胞鈣化程度，通過MDC特異性染色觀察細胞的自噬小泡，運用RealtimeRT-PCR和Western blotting檢測軟骨相關基因以及自噬相關基因的表達變化；運用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光標記的LC3基因的表達。 結果:LIVE/DEADò染色結果表明，對照組、加力組和加力加藥組中終板軟骨細胞的活力及粘附力無明顯差異。Realtime RT-PCR和Western blotting的檢測結果顯示，在ICMT刺激下，，終板軟骨細胞中自噬相關基因的表達水平出現(xiàn)明顯下調。堿性磷酸酶染色和茜素紅染色的實驗結果表明：同對照組相比，添加雷帕霉素的加力加藥組和加力組中終板軟骨細胞在ICMT誘導下，出現(xiàn)明顯的鈣化結節(jié)；且加力加藥組中終板軟骨細胞的鈣化程度明顯低于加力組。Realtime RT-PCR的結果顯示加力加藥組和加力組的終板軟骨細胞中軟骨相關基因的表達水平明顯低于對照組，且加力加藥組細胞中軟骨相關基因的表達水平高于加力組。 結論:本課題研究表明ICMT誘導終板軟骨細胞鈣化及抑制自噬的表達水平，而通過雷帕霉素上調自噬水平可以部分抑制細胞的鈣化現(xiàn)象，我們推測自噬作為一種宿主保護機制，可能與張力誘導的終板軟骨退變及椎間盤退變過程有關。
【關鍵詞】：間斷周期性牽張力 鈣化 終板軟骨細胞 自噬
【學位授予單位】：皖南醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R363
【目錄】：

• 中英文縮略詞對照表5-9
• 摘要9-11
• Abstract11-13
• 前言13-16
• 研究內容與方法16-31
• 1. 研究內容16-17
• 1.1 大鼠終板軟骨細胞的分離與培養(yǎng)16
• 1.2 觀察對照組和加力組的終板軟骨細胞表型的變化16
• 1.3 觀察張力誘導后，終板軟骨細胞自噬標志性基因的表達變化16
• 1.4 觀察雷帕霉素對終板軟骨細胞退變中自噬水平的變化及作用16-17
• 1.5 觀察自噬在張力誘導終板軟骨細胞退變過中的作用17
• 2. 材料17-19
• 2.1 細胞培養(yǎng)試劑和儀器17-18
• 2.2 力學刺激裝置18
• 2.3 染色相關試劑18
• 2.4 RNA 提取，Realtime-PCR 試劑和儀器18-19
• 2.5 Western-blot 試劑和儀器19
• 3.方法19-29
• 3.1 大鼠腰椎原代終板軟骨細胞的分離與培養(yǎng)19-20
• 3.2 細胞傳代與分組20
• 3.3 細胞凍存與復蘇20-21
• 3.4 細胞粘附力及活力檢測21-22
• 3.5 鈣化結節(jié)檢測22-23
• 3.6 實時熒光定量 PCR 法測定基因 mRNA 的表達變化23-25
• 3.7 Western-blotting 法測定蛋白的表達25-28
• 3.8 MDC 染色步驟28
• 3.9 激光共聚焦檢測細胞中 LC3 基因蛋白表達28-29
• 3.10 誘導實驗29
• 4. 統(tǒng)計學方法29-30
• 5. 附：技術路線圖30-31
• 結果31-39
• 討論39-45
• 結論45-46
• 參考文獻46-53
• 附錄53-56
• 綜述56-66
• 參考文獻61-66
• 作者簡介及讀研期間主要科研成果66-67
• 致謝67-68

【參考文獻】

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  本文關鍵詞：自噬對張力誘導終板軟骨細胞鈣化的影響研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：439056