發(fā)布時間：2017-06-10 01:01

  本文關(guān)鍵詞：Tg737基因在胎肝干細(xì)胞分化過程中的作用及機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：胎肝干細(xì)胞具有能分化為肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞的特點，為基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用搭建了更寬闊的平臺，干細(xì)胞治療各類肝臟疾病的構(gòu)想和實踐與再生醫(yī)學(xué)的理念不謀而合，其前景是光明遠(yuǎn)大的。同時大量的研究表明干細(xì)胞與腫瘤干細(xì)胞有著微妙的聯(lián)系，干細(xì)胞的分化異�？赡軐�(dǎo)致惡變，甚至引發(fā)腫瘤。因此，正反兩個方面都說明了探究胎肝干細(xì)胞正常分化過程中受到哪些關(guān)鍵分子、蛋白抑或信號通路的調(diào)控及其潛在機制的重要性和必要性。目的 本研究以胎肝干細(xì)胞的正常分化為切入點，擬初步探索Tg737基因在胎肝干細(xì)胞分化過程中所起的作用及其潛在的分子機制。研究內(nèi)容分為兩部分：1、Tg737基因在胎肝干細(xì)胞分化過程中的表達及作用；2、初步探討Tg737基因調(diào)控胎肝干細(xì)胞分化的機制。 方法 1.三步分離法收集胎肝干細(xì)胞；HGF（20ng/ml）誘導(dǎo)胎肝干細(xì)胞一周，選取第1、3、5、7天定為后續(xù)實驗的檢測點，PCR連續(xù)監(jiān)測ALB和AFP的mRNA表達變化；在上述4個時間點，Western blot連續(xù)監(jiān)測Tg737蛋白的表達變化；慢病毒Tg737-shRNA轉(zhuǎn)染胎肝干細(xì)胞，分為實驗組和對照組，PCR、Western blot檢測沉默效果；流式細(xì)胞術(shù)連續(xù)檢測兩組細(xì)胞的CD133表達變化；PCR連續(xù)監(jiān)測兩組細(xì)胞ALB和AFP的表達變化；在培養(yǎng)第7天，透射電鏡觀察兩組細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)差異。 2. PCR、Western blot連續(xù)監(jiān)測HNF4α在正常胎肝干細(xì)胞分化過程中的表達變化；在培養(yǎng)第7天以Western blot、PCR檢測實驗組和對照組細(xì)胞中HNF4α蛋白和mRNA的表達情況；免疫熒光技術(shù)檢測兩組細(xì)胞中β-catenin的表達情況；Western blot檢測兩組細(xì)胞中Snail蛋白的表達情況。 結(jié)果 1.三步分離法能有效富集胎肝干細(xì)胞；在HGF（20ng/ml）誘導(dǎo)正常胎肝干細(xì)胞的第1、3、5、7天，AFP的mRNA表達逐漸降低，ALB的mRNA表達逐漸升高；在誘導(dǎo)分化過程中，Tg737的蛋白表達逐漸升高；慢病毒-shRNA能有效下調(diào)Tg737的mRNA和蛋白表達；在HGF誘導(dǎo)分化過程中，流式細(xì)胞技術(shù)檢測兩組細(xì)胞CD133的表達，發(fā)現(xiàn)在第1天，二者的表達無顯著差異，隨著誘導(dǎo)的進行，相比對照組，實驗組CD133表達的下降更緩慢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p0.05）；實驗組AFP和ALB的mRNA水平均無明顯變化（p0.05）；在第7天以透射電鏡觀察兩組細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)：實驗組的細(xì)胞核大且富含異染色質(zhì)，胞質(zhì)稀疏且細(xì)胞器極少，核質(zhì)比大，細(xì)胞表面絨毛的數(shù)量稀少；對照組細(xì)胞的核質(zhì)比很低，細(xì)胞都已極化，細(xì)胞質(zhì)中含有大量的線粒體、溶酶體、發(fā)育良好的高爾基體等細(xì)胞器，顯示出早期分化的特點。 2.在HGF（20ng/ml）誘導(dǎo)正常胎肝干細(xì)胞分化的第1、3、5、7天，PCR、Westernblot連續(xù)監(jiān)測提示：HNF4α的mRNA和蛋白水平都逐漸增加（p0.05）；相比對照組，實驗組HNF4α的mRNA和蛋白水平都顯著下調(diào)（p0.05），，核內(nèi)的β-catenin表現(xiàn)出更強的免疫反應(yīng)性即Wnt/β-catenin呈過度激活表現(xiàn)，Snail蛋白表達上調(diào)。 結(jié)論 1.三步分離法能有效富集胎肝干細(xì)胞，HGF（20ng/ml）能有效誘導(dǎo)胎肝干細(xì)胞向正常肝細(xì)胞分化。 2. Tg737基因參與調(diào)控胎肝干細(xì)胞向正常肝細(xì)胞的分化，抑制Tg737的表達導(dǎo)致胎肝干細(xì)胞分化受阻。 3. HNF4α參與胎肝干細(xì)胞的正常分化過程；Tg737基因的缺失導(dǎo)致HNF4α表達下調(diào)，Wnt/β-catenin信號通路過度激活，并可能通過促進胎肝干細(xì)胞發(fā)生EMT，從而抑制其正常分化。
【關(guān)鍵詞】：胎肝干細(xì)胞 分化/抑分化 Tg737 HNF4α β-catenin EMT/MET
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R3416
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-12
• 前言12-14
• 文獻回顧14-38
• 一、肝干/祖細(xì)胞14-23
• 二、Tg73723-30
• 三、HNF4α30-38
• 實驗一 TG737基因在胎肝干細(xì)胞分化過程中的表達及作用38-56
• 1 引言38
• 2 材料38-41
• 3 方法41-47
• 4 結(jié)果47-53
• 5 討論53-56
• 實驗二 TG737基因調(diào)控胎肝干細(xì)胞分化的機制研究56-68
• 1 引言56
• 2 材料56-57
• 3 方法57-60
• 4 結(jié)果60-64
• 5 討論64-68
• 小結(jié)68-69
• 參考文獻69-81
• 個人簡歷和研究成果81-83
• 致謝83-84

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本文編號：437016