本文關(guān)鍵詞：OCILRP2在小鼠T細(xì)胞活化中的共刺激作用及其機制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景 T淋巴細(xì)胞在體內(nèi)主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，整個應(yīng)答過程分為三個階段：T細(xì)胞特異性識別抗原階段，T細(xì)胞活化、增殖和分化階段，T細(xì)胞應(yīng)答的效應(yīng)階段。T細(xì)胞共刺激在T細(xì)胞活化、增殖、分化和生存中發(fā)揮重要作用。 共刺激涉及效應(yīng)淋巴細(xì)胞表面配體受體的相互作用。破骨細(xì)胞抑制凝集素相關(guān)蛋白2（Osteoclast inhibit lectin related protein2, OCILRP2）基因最初從成骨細(xì)胞中分離獲得，它高表達(dá)于脾臟、胸腺、B淋巴細(xì)胞、DC及活化的T細(xì)胞中，而靜止的T細(xì)胞中OCILRP2的表達(dá)水平很低。研究表明OCILRP2是小鼠T細(xì)胞活化共刺激中的一個重要的活化受體，其配體為NKRP1f。 OCILRP2是C型凝集素樣受體分子。C型凝集素樣受體分子在固有免疫及獲得性免疫應(yīng)答中通過與其配體結(jié)合而發(fā)揮重要的作用，其家族成員NKG2D缺少細(xì)胞質(zhì)信號傳導(dǎo)基序，因而通過與不同的接頭蛋白結(jié)合激活NK細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞。OCILRP2蛋白胞內(nèi)段很短，同樣缺少細(xì)胞質(zhì)信號傳導(dǎo)基序，不能傳遞信號，所以我們推測OCILRP2可能類似于NKG2D,通過與跨膜接頭蛋白DAP12相互作用而活化下游信號通路。研究表明OCILRP2沉默的T細(xì)胞中酪氨酸磷酸化的lck減少，活化的T細(xì)胞中PI3-K的酪氨酸磷酸化不變。然而OCILRP2共刺激T細(xì)胞活化的確切機制及相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路尚不清楚。 目的 研究OCILRP2在小鼠T細(xì)胞活化過程中的共刺激作用及其機制，鑒定與OCILRP2發(fā)揮協(xié)同作用的接頭蛋白，探索其介導(dǎo)T細(xì)胞活化的信號通路，豐富T細(xì)胞活化的共刺激理論，為深入理解T細(xì)胞活化的分子機制提供新線索。 方法 通過免疫共沉淀、GST pull down、激光共聚焦顯微鏡CLSM等實驗鑒定與OCILRP2相互作用的接頭蛋白分子。構(gòu)建了全長、胞內(nèi)段、胞外段加跨膜區(qū)重組OCILRP2蛋白，用來分析OCILRP2與接頭蛋白分子相互作用的區(qū)域。CD3/CD28抗體及PMA刺激小鼠T淋巴瘤EL4細(xì)胞，，檢測刺激前后細(xì)胞因子的分泌、細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期等生物學(xué)特征，運用熒光定量PCR技術(shù)檢測某些轉(zhuǎn)錄因子的變化，同時用免疫印跡技術(shù)尋找與OCILRP2相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。 結(jié)果 成功構(gòu)建了GST-DAP12、GST-OCILRP2胞內(nèi)段、GST-OCILRP2胞外段加跨膜區(qū)的融合蛋白，鑒定出OCILRP2與接頭蛋白分子DAP12相互作用，且只有胞外段加跨膜區(qū)的重組蛋白可與DAP12蛋白質(zhì)相互作用，DAP12與Ras不發(fā)生相互作用。 激光共聚焦結(jié)果顯示OCILRP2與DAP12在EL4細(xì)胞膜上共定位。 靜止的EL4細(xì)胞系中OCILRP2主要在細(xì)胞漿中表達(dá)，用CD3/CD28抗體激活的EL4細(xì)胞，受體由胞內(nèi)轉(zhuǎn)運到細(xì)胞表面，而用PMA處理的EL4細(xì)胞沒有表現(xiàn)出這種易位現(xiàn)象。DAP12經(jīng)抗體刺激前后其膜上蛋白表達(dá)情況不發(fā)生改變。 小鼠淋巴瘤細(xì)胞EL4在未受到任何刺激的情況下分泌IL-2的水平很低，經(jīng)CD3/CD28抗體刺激后，EL4分泌IL-2的水平顯著升高。并且隨著CD3抗體濃度的升高和刺激時間的加長，IL-2的分泌水平也增高，摸索出CD3/CD28抗體刺激EL4細(xì)胞的最佳抗體濃度和刺激時間。不同處理組對EL4細(xì)胞進(jìn)行刺激48h，發(fā)現(xiàn)加入了OCILRP2抗體組的IL-2的分泌水平有所降低。CD3/CD28抗體濃度增加，對EL4細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用，加入OCILRP2抗體組與沉默組EL4增殖情況較CD3/CD28抗體減慢。而加入外源性IL-2抗體并不影響EL4細(xì)胞的增殖。OCILRP2不影響EL4細(xì)胞的細(xì)胞周期。anti-OCILRP2抗體與si-OCILRP2質(zhì)粒均能使EL4細(xì)胞的凋亡情況減少。 抗CD3/CD28抗體可明顯促進(jìn)IL-2, NF-κB, NF-AT, MAPK3, MAPK8mRNA合成。 OCILRP2沉默使MAPK3和MAPK8的活化減少。 結(jié)論 OCILRP2與DAP12相互作用，通過MAPK通路進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而為T細(xì)胞活化提供共刺激信號。
【關(guān)鍵詞】：OCILRP2 DAP12 EL4 T細(xì)胞活化 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R392;R329.2
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-12
• 英文縮略詞表12-13
• 引言13-15
• 1 材料與方法15-35
• 1.1 主要儀器設(shè)備15
• 1.2 主要試劑與材料15-17
• 1.3 主要試劑配制17-23
• 1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)所用試劑的配制17-18
• 1.3.2 細(xì)菌實驗所用試劑的配制18
• 1.3.3 分子實驗所用試劑的配制18-19
• 1.3.4 蛋白電泳所用溶液的配制19-23
• 1.3.5 激光共聚焦實驗所用試劑的配制23
• 1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測所用試劑的配制 FACS buffer(100mL)23
• 1.4 方法23-35
• 1.4.1 細(xì)胞復(fù)蘇，培養(yǎng)，傳代與凍存23-24
• 1.4.2 小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分離24-25
• 1.4.3 分子克隆質(zhì)粒載體的構(gòu)建25
• 1.4.4 質(zhì)粒提取25
• 1.4.5 膠回收25
• 1.4.6 酶切25
• 1.4.7 連接25
• 1.4.8 感受態(tài)的制備25-26
• 1.4.9 轉(zhuǎn)化26
• 1.4.10 質(zhì)粒 DNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞26
• 1.4.11 細(xì)胞裂解及蛋白抽提26-27
• 1.4.12 BCA 法測濃度27
• 1.4.13 SDS-page 與 Western Blot27-29
• 1.4.14 CO-IP29
• 1.4.15 原核蛋白誘導(dǎo)表達(dá)29
• 1.4.16 原核蛋白純化29-30
• 1.4.17 GST pull down30
• 1.4.18 免疫熒光激光共聚焦30
• 1.4.19 流式細(xì)胞術(shù)檢測 EL4 細(xì)胞表面 OCILRP2 蛋白表達(dá)30-31
• 1.4.20 抗體包被的方法31
• 1.4.21 EL4 細(xì)胞/小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的活化及其細(xì)胞因子的誘生31
• 1.4.22 EL4 細(xì)胞分泌 IL-2 水平的 ELISA 檢測31
• 1.4.23 小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分泌 IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ的 ELISA 檢測31
• 1.4.24 細(xì)胞增殖實驗31-32
• 1.4.25 細(xì)胞周期實驗32
• 1.4.26 RNA 的提取32
• 1.4.27 cDNA 的合成32-33
• 1.4.28 Real time PCR 反應(yīng)33
• 1.4.29 統(tǒng)計學(xué)方法33-35
• 2 結(jié)果35-49
• 2.1 OCILRP2 相互作用蛋白的鑒定35-39
• 2.1.1 GST-DAP12 原核蛋白的表達(dá)35
• 2.1.2 GST-OCILRP2 原核蛋白的表達(dá)35-36
• 2.1.3 GST pull down 驗證 DAP12 與 OCILRP2 蛋白的相互作用36
• 2.1.4 CO-IP 驗證 DAP12 與 OCILRP2 蛋白的相互作用36-37
• 2.1.5 DAP12 與 OCILRP2 蛋白結(jié)合位置分析37
• 2.1.6 激光共聚焦分析 OCILRP2 與 DAP12 在胞膜上的共定位37-38
• 2.1.7 OCILRP2 與 DAP12 結(jié)合的工作模型38-39
• 2.1.8 CO-IP 實驗鑒定 DAP12 與 Ras 不發(fā)生相互作用39
• 2.2 OCILRP2 對 T 細(xì)胞功能的影響39-46
• 2.2.1 EL4 細(xì)胞中 OCILRP2 的沉默效果39-40
• 2.2.2 CD3/CD28 抗體在不同濃度及不同時間點刺激 EL4 分泌 IL-2 水平(pg/mL）比較40-41
• 2.2.3 小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分泌 IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ的 ELISA 檢測（OD450）41
• 2.2.4 CD3/CD28 抗體、OCILRP2 抗體及沉默組對 EL4 細(xì)胞增殖的影響41-42
• 2.2.5 CD3/CD28 抗體、OCILRP2 抗體、沉默質(zhì)粒、PMA 對 EL4 細(xì)胞周期的影響42-44
• 2.2.6 OCILRP2 對細(xì)胞凋亡的影響44
• 2.2.7 CD3/28 抗體、PMA 刺激對 EL4 細(xì)胞表面 OCILRP2 蛋白表達(dá)的影響44-45
• 2.2.8 CD3/28 抗體、PMA 刺激對 EL4 細(xì)胞表面 DAP12 蛋白表達(dá)的影響45-46
• 2.3 OCILRP2 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的分析46-49
• 2.3.1 Western Blot 檢測 OCILRP2 在細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)46-47
• 2.3.2 CD3/CD28 抗體刺激組、CD3/CD28/OCILRP2 抗體刺激組、正常 EL4 細(xì)胞組核轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)差異的定量分析47-49
• 3 討論49-53
• 4 結(jié)論53-55
• 5 參考文獻(xiàn)55-57
• 文獻(xiàn)綜述57-67
• 參考文獻(xiàn)64-67
• 致謝67-68
• 在讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及研究成果68-69

【共引文獻(xiàn)】

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 劉紫玲;肺炎支原體莢膜多糖結(jié)合DC-SIGN對DC分泌細(xì)胞因子及成熟的影響[D];南華大學(xué);2013年

  本文關(guān)鍵詞：OCILRP2在小鼠T細(xì)胞活化中的共刺激作用及其機制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：425722