本文關(guān)鍵詞：輪狀病毒與腸道病毒71型的重組嵌合基因工程疫苗初步研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：人輪狀病毒(Human Rotavirus, RV),是引起嬰幼兒腹瀉的主要病原體之一,其主要感染小腸上皮細(xì)胞,從而造成細(xì)胞損傷,引起腹瀉。輪狀病毒每年在夏秋冬季節(jié)流行,并在世界范圍內(nèi)造成大量嬰幼兒死亡病例。目前尚無(wú)針對(duì)輪狀病毒引起的腹瀉的有效治療手段,因而采用疫苗預(yù)防嬰幼兒感染是目前的主要手段。目前國(guó)內(nèi)外的上市輪狀病毒疫苗均為減毒輪狀病毒疫苗,在預(yù)防RV的感染過(guò)程中發(fā)揮了一定的作用,但也存在引發(fā)腸套疊、毒力返祖及外源因子污染等問(wèn)題。腸道病毒71型(Human Enteroirus71, EV71), EV71是引起嬰幼兒手足口病(Hand-Foot And Mouth Disease, HFMD)的主要病原體之一,多發(fā)生于5歲以下兒童,可引起手、足、口腔等部位的皰疹,少數(shù)患兒可引起心肌炎、肺水腫、無(wú)菌性腦膜炎等并發(fā)癥甚至導(dǎo)致死亡。EV71滅活疫苗的研發(fā)過(guò)程中,存在著高保護(hù)效力高遺傳穩(wěn)定性毒株篩選等問(wèn)題,目前國(guó)內(nèi)外有數(shù)個(gè)EV71滅活疫苗項(xiàng)目正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。EV71減毒活疫苗的研發(fā)過(guò)程中出現(xiàn)遺傳不穩(wěn)定及引發(fā)個(gè)別并發(fā)癥問(wèn)題。綜上,本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)構(gòu)建同時(shí)包含RV及EV71主要抗原表位的亞單位疫苗,并通過(guò)免疫刺激最終對(duì)RV及EV71起到一定的保護(hù)作用。 輪狀病毒VP4蛋白作為輪狀病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白,決定輪狀病毒的血清P型,主要具有與細(xì)胞受體結(jié)合并穿透細(xì)胞、血凝反應(yīng)等功能,并能決定輪狀病毒的毒力,引起較強(qiáng)的中和反應(yīng)。VP4或其亞片段能刺激有效的免疫反應(yīng)產(chǎn)生,因而VP4特別適合用于亞單位疫苗的研究。該蛋白在胰蛋白酶的作用下可裂解為VP5和VP8兩個(gè)肽段。目前主要鑒定出的VP4中和抗原表位肽大都集中在氨基端的VP8肽段。EV71基因組為單股正鏈RNA,基因組全長(zhǎng)約7500bp,編碼一個(gè)開(kāi)放閱讀框,翻譯約2200個(gè)氨基酸的前體蛋白,前體蛋白可水解為VP1、VP2、VP3、VP4四個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白并包裝病毒顆粒,其中除VP4位于病毒顆粒內(nèi)側(cè)外,VP1-3三個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白均暴露于病毒顆粒表面,EV71VP1蛋白作為EV71的結(jié)構(gòu)蛋白,具有EV71主要的抗原決定簇,是病毒主要的中和決定因子�；谳啝畈《炯澳c道病毒71型的以上特點(diǎn),結(jié)合文獻(xiàn)、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、親疏水性與抗原表位分布的軟件分析預(yù)測(cè),本實(shí)驗(yàn)選取約800bp左右包括VP8全長(zhǎng)與VP5部分片段的基因片段的VP4*片段及EV71VP1全長(zhǎng)用于重組嵌合蛋白的構(gòu)建。 本實(shí)驗(yàn)共設(shè)計(jì)RV VP4*、EV71VP1、RV VP4*-EV71VP1、EV71VP1-RV VP4*四個(gè)實(shí)驗(yàn)組,結(jié)合分析軟件結(jié)果,預(yù)期RV VP4*-EV71VP1實(shí)驗(yàn)組能保持較穩(wěn)定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)并起到較好的免疫效果。 前期大腸桿菌BL21株pET20b/30a/pthio原核表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,通過(guò)原核表達(dá)途徑不能夠較好的獲得預(yù)期的四個(gè)實(shí)驗(yàn)組蛋白,結(jié)合文獻(xiàn)資料與實(shí)驗(yàn)分析推測(cè)原因如下：1、RV VP4*蛋白具有細(xì)胞毒性,會(huì)阻礙大腸桿菌的正常表達(dá)和生長(zhǎng),2、選取的原核表達(dá)系統(tǒng)缺少這兩個(gè)蛋白的個(gè)別稀有密碼子,3、mRNA高級(jí)結(jié)構(gòu)或會(huì)阻礙目的蛋白的翻譯。鑒于重新選取目的基因片段的難度和時(shí)間問(wèn)題,故決定采用腺病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建包含目的蛋白的重組腺病毒。 后期實(shí)驗(yàn)包裝并獲得了具有RV VP4*、EV71VP1、RV VP4*-EV71VP1、EV71VP1-RV VP4*目的蛋白片段的四個(gè)重組腺病毒,感染重組腺病毒的細(xì)胞總RNA RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果及免疫熒光實(shí)驗(yàn)證明,四個(gè)重組腺病毒均能較好的轉(zhuǎn)錄和翻譯目的基因。經(jīng)過(guò)傳代獲得初步純化的重組腺病毒并進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn),動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,四個(gè)重組腺病毒均能刺激機(jī)體產(chǎn)生相對(duì)應(yīng)的特異性抗體。目前實(shí)驗(yàn)未能發(fā)現(xiàn)含有目的基因的重組腺病毒所刺激產(chǎn)生的抗血清具有對(duì)EV71及RV的保護(hù)作用,推測(cè)因?yàn)槊庖咴囼?yàn)動(dòng)物的病毒滴度不高及實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)較少等原因造成,因此含有目的基因的重組腺病毒對(duì)于EV71及RV的中和保護(hù)作用尚不能定論,需做進(jìn)一步的研究。在比較兩種表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)異性及分析比對(duì)多個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)組的過(guò)程中,為未來(lái)的輪狀病毒及腸道病毒71型基因工程聯(lián)合疫苗研發(fā)工作提供了一定啟示和思路。
【關(guān)鍵詞】：輪狀病毒 EV71 重組嵌合
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 前言10-14
• 第一部分 原核表達(dá)RV與EV71的重組嵌合基因工程疫苗初步研究14-30
• 實(shí)驗(yàn)材料與方法14-22
• 實(shí)驗(yàn)材料14-15
• 實(shí)驗(yàn)方法15-22
• 結(jié)果與分析22-27
• 討論27-29
• 小結(jié)29-30
• 第二部分 RV與EV71嵌合基因在重組藤病毒系統(tǒng)中的表達(dá)及免疫學(xué)評(píng)價(jià)30-59
• 實(shí)驗(yàn)材料與方法30-44
• 實(shí)驗(yàn)材料30-32
• 實(shí)驗(yàn)方法32-44
• 結(jié)果與分析44-57
• 討論57-58
• 小結(jié)58-59
• 參考文獻(xiàn)59-62
• 附錄62-70
• 縮略詞62-63
• 主要溶液配方63-65
• 測(cè)序結(jié)果65-70
• 文獻(xiàn)綜述70-75
• 參考文獻(xiàn)73-75
• 致謝75

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 陳元鼎,劉名英,鄒永健,彭梅,戴長(zhǎng)柏,FranciscoE．Baralle;表達(dá)輪狀病毒SA11株Vp4的抗原表位誘導(dǎo)病毒中和抗體生成[J];中國(guó)病毒學(xué);1997年02期

  本文關(guān)鍵詞：輪狀病毒與腸道病毒71型的重組嵌合基因工程疫苗初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：425135