發(fā)布時間：2017-06-03 18:03

  本文關鍵詞：雜合抗菌肽Cecropin P1-Dermaseptin S4在畢赤酵母中的分泌表達及活性檢測，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的： 將兩種抗菌肽優(yōu)化后的基因片段進行拼接，通過構建攜帶融合基因的表達載體pPICZαA-cp1-ds4并在畢赤酵母X-33中高效分泌表達，并研究雜合抗菌肽Cecropinp1-Dermaseptin S4的抗菌活性、穩(wěn)定性及抗腫瘤活性。 方法： 1．將兩種抗菌肽氨基酸序列組合在一起利用Antheprot release5.0預測雜合抗菌肽Cecropin P1-Dermaseptin S4的二級結構，利用The antimicrobial peptidesdatabases(APD)預測雜合抗菌肽的理化性質及成為抗菌肽的可能性。 2.抗菌肽Dermaseptin S4基因的克�。焊鶕叧嘟湍傅拿艽a子偏愛性和Genbank中Dermaseptin S4的氨基酸序列以及部分Cecropin P1C-末端的部分氨基酸序列，設計適當?shù)钠唇右锿ㄟ^重疊延伸PCR（SOE-PCR）進行拼接，將拼接產物克隆至pMD18-T載體轉化大腸桿菌DH5α后測序。 3.雜合抗菌肽基因的克�。悍謩e以保存Cecropin P1和Dermaseptin S4正確序列的pPICZαA-cp1和pMD18T-ds4質粒為模板，以各自特異性引物為引物進行PCR擴增后通過SOE-PCR拼接兩基因片段，，將拼接片段克隆至pMD18-T載體轉化大腸桿菌DH5α后測序。 4.表達載體pPICZα-cp1-ds4的構建：重組質粒pMD18T-cp1-ds4和表達載體pPICZα-A分別經EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切后利用T4DNA連接酶進行連接并轉化大腸桿菌DH5α后測序。 5.重組酵母菌pPICαA-cp1-ds4/X-33的構建：將表達載體pMD18T-cp1-ds4經Sac I線性化后，采用EMC830電穿孔儀低電壓模式電轉化酵母并利用100mg/L Zeocin進行篩選。 6.重組子誘導表達及初步活性檢測：采用BMGY和BMMY誘導培養(yǎng)基以0.5%（v/v）甲醇濃度進行培養(yǎng)，利用Tricine-SDS-PAGE檢測目的多肽的表達并采用瓊脂擴散法檢測濃縮上清中雜合抗菌肽Cecropin P1-Dermaseptin S4的抗菌活性。 7.表達產物的純化：通過提高Zeocin的濃度篩選多拷貝酵母重組子，利用BMGY和BMMY誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)并采用AKTA蛋白純化系統(tǒng)進行純化。 8.抗菌譜及最小抑菌濃度測定：分別采用瓊脂擴散法和微量稀釋法測定雜合抗菌肽Cecropin P1-Dermaseptin S4的抗菌譜及最小抑菌濃度。 9.采用Hultmark等通過計算抗菌活力來表征抗菌肽的抑菌能力的方法衡量雜合抗菌肽Cecropin P1-Dermaseptin S4的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性及胰酶消化穩(wěn)定性。 10.采用MTT法來研究雜合抗菌肽Cecropin P1-Dermaseptin S4作用于小鼠骨髓瘤細胞SP2/0的效果。 結果： 1.經Antheprot release5.0預測雜合抗菌肽Cecropin P1-Dermaseptin S4的二級結構發(fā)現(xiàn)雜合多肽依然能夠保持N-末端和C-末端為雙螺旋結構，兩螺旋結構之間存在疏松了連接片段，經APD預測雜合抗菌肽有成為抗菌肽的可能。 2.經SOE-PCR成功將拼接引物拼接成Dermaseptin S4基因，大小約120bp，將其克隆至pMD18-T載體后轉化大腸桿菌DH5α并測序，測序結果顯示序列與設計序列一致。 3.經SOE-PCR成功將Cecropin P1和Dermaseptin S4基因片段拼接后，將其克隆至pMD18-T載體后轉化大腸桿菌DH5α并測序，測序結果顯示序列與設計序列一致。 4. pMD18T-cp1-ds4和表達載體pPICZα-A經雙酶切、酶連反應后，重組表達質粒轉化大腸桿菌DH5α并測序，測序結果顯示開放閱讀框完全正確，所編碼的氨基酸序列與設計一致。 5.表達載體pPICαA-cp1-ds4經Sac I線性化后在ECM830低電壓模式（電壓為350V，脈沖時間15s，脈沖次數(shù)1次）下可成功電轉化畢赤酵母X-33，用Zeocin篩選得到陽性重組子。 6.瓊脂擴散法初步檢測對大腸埃希菌和經黃色葡萄球菌的作用效果，加入濃縮表達上清均有抑菌環(huán)形成。 7.提高Zeocin濃度篩選多拷貝重組子，結果得到的菌株對Zeocin最大的耐受濃度為400mg/L，用多拷貝重組子表達目的多肽其產量約為30mg/L，經AKTA蛋白純化系統(tǒng)純化后可得一特異性蛋白條帶。 8.抗菌譜測定實驗中對選取的大腸桿菌DH5α、金黃色葡萄球菌、嗜酸乳桿菌、枯草芽孢桿菌、志賀氏菌SDCDC563、鼠傷寒沙門氏菌CMCC50222均有抑制作用其最小抑菌濃度分別約為37.5μg/ml、75ug/ml、75ug/ml、150ug/ml、150ug/ml、150ug/ml，對銅綠假單孢菌27853無效。 9.對雜合抗菌肽進行熱、酸堿和胰酶消化后仍能保持較高的抑菌活力。 10.通過MTT實驗，雜合抗菌肽對小鼠骨髓瘤細胞存在抑制作用。 結論： 能夠利用基因工程手段成功分泌表達雜合抗菌肽Cecropin P1-Dermaseptin S4，研究結果表明該雜合肽對多種革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌表現(xiàn)出抑菌作用，該雜合抗菌肽具有較好的熱、酸堿和抗胰酶消化穩(wěn)定性；對小鼠骨髓瘤細胞SP2/0有一定的抑制效果。
【關鍵詞】：雜合抗菌肽 Cecropin P1 Dermaseptin S4 分泌表達 生物活性
【學位授予單位】：濟南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R3416
【目錄】：

• 研究生導師及課題指導小組簡介5-7
• 摘要7-10
• Abstract10-14
• 主要符號14-16
• 第一章 前言16-24
• 1.1 抗菌肽概述16-17
• 1.2 抗菌肽分類17-18
• 1.3 抗菌肽作用機制18-20
• 1.4 應用及展望20-21
• 1.5 Cecropin P1 研究現(xiàn)狀21
• 1.6 Dermaseptin S4 研究現(xiàn)狀21-22
• 1.7 課題創(chuàng)新點及研究意義22-24
• 第二章 雜合抗菌肽 Cecropin P1-Dermaseptin S4 在畢赤酵母中的誘導表達24-48
• 2.1 材料與方法24-37
• 2.2 結果37-45
• 2.3 討論45-48
• 第三章 雜合抗菌肽 CecropinP1-DermaseptinS4 的純化及抗菌作用研究48-60
• 3.1 材料與方法48-53
• 3.2 結果53-58
• 3.3 討論58-60
• 第四章 雜合抗菌肽 Cecropin P1-Dermaseptin S4 作用于小鼠骨髓瘤細胞 SP2/0 的效果研究60-64
• 4.1 材料和方法60-62
• 4.2 結果62-63
• 4.3 討論63-64
• 結論64-65
• 參考文獻65-71
• 附錄71-78
• 綜述78-90
• 參考文獻86-90
• 攻讀學位期間取得的研究成果90-91
• 致謝91

【參考文獻】

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  本文關鍵詞：雜合抗菌肽Cecropin P1-Dermaseptin S4在畢赤酵母中的分泌表達及活性檢測，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：418818