本文關(guān)鍵詞：IL-6受體融合蛋白的表達及初步鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的白細胞介素6(Interleukin-6，IL-6)由多種細胞如單核細胞，成纖維細胞，內(nèi)皮細胞，肝細胞，淋巴細胞，腫瘤細胞產(chǎn)生的多功能細胞因子，可以參與機體多種反應(yīng)，比如刺激多種細胞增殖分化，骨髓造血，自身免疫和機體防御等。IL-6在哮喘、多發(fā)性硬化、慢性類風濕性關(guān)節(jié)炎，炎癥性腸炎等多種免疫性疾病中水平異常增高，且阻斷IL-6后疾病嚴重程度減輕。本課題根據(jù)鼠IL-6受體結(jié)構(gòu)特點構(gòu)建表達出可以阻斷IL-6信號通路的鼠IL-6受體融合蛋白（mouse IL-6receptorfusion protein，mIL-6-RFP），為后期研究IL-6在炎癥性疾病模型中的作用奠定了基礎(chǔ)。 方法首先設(shè)計引物，以mIL-6-RFP-pcDNA3.1質(zhì)粒為模板擴增出目的基因mIL-6-RFP。隨后將mIL-6-RFP與高效克隆PCR產(chǎn)物的專用載體pMD18-T連接后轉(zhuǎn)化XL1-BLue。擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒為mIL-6-RFP-pMD18-T，將mIL-6-RFP-pMD18-T與桿狀病毒表達系統(tǒng)轉(zhuǎn)移載體pFastBacHTA酶切后連接，而后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α。擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒為mIL-6-RFP-pFastBacHTA，經(jīng)測序鑒定正確后轉(zhuǎn)化含有Bacmid載體的大腸桿菌DH10Bac，在DH10Bac菌體內(nèi)，mIL-6-RFP-pFastBacHTA上的mIL-6-RFP轉(zhuǎn)座到Bacmid的乳糖操縱子盒式結(jié)構(gòu)中得到重組Bacmid。重組Bacmid通過連續(xù)兩次抗生素加藍白斑篩選獲得陽性單克隆，擴大培養(yǎng)后用大型質(zhì)粒提取試劑盒提取重組Bacmid。采用PCR方法鑒定重組Bacmid，引物為pUC/M13。鑒定結(jié)果正確后，利用脂質(zhì)體Cellfectin介導(dǎo)重組Bacmid轉(zhuǎn)染Sf9細胞，并通過觀察細胞病變確定轉(zhuǎn)染是否成功。當轉(zhuǎn)染成功后收集細胞上清為具有感染性的第一代重組病毒粒子。隨后用第一代重組病毒粒子感染Sf9收集上清為第二代病毒，同時收集細胞提取細胞內(nèi)總蛋白經(jīng)Western Blot鑒定目的蛋白是否表達。而后用第二代病毒感染Sf9獲得第三代病毒。采用空斑試驗檢測第三代病毒的滴度。蛋白表達前，在24孔板上摸索蛋白表達的優(yōu)化條件，同時將單層培養(yǎng)的細胞馴化為懸浮旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。當懸浮培養(yǎng)達到600ml后用第三代病毒感染Sf9。收集細胞及培養(yǎng)基進行蛋白純化獲得大量目的蛋白mIL-6-RFP。 結(jié)果經(jīng)過基因重組技術(shù)成功將目的基因插入轉(zhuǎn)移載體pFastBacHTA得到重組pFastBacHTA，命名為mIL-6RFP-pFastBacHTA，重組質(zhì)粒經(jīng)測序鑒定正確后成功轉(zhuǎn)化DH10Bac細菌，挑選經(jīng)抗生素及藍白斑兩次篩選成功獲得出的白色陽性單克隆，擴大培養(yǎng)后用大型質(zhì)粒提取試劑盒成功提取出重組Bacmid，經(jīng)PCR鑒定后約在4500bp處左右出現(xiàn)目的條帶。重組Bacmid轉(zhuǎn)染昆蟲細胞Sf9，轉(zhuǎn)染后第五天出現(xiàn)細胞病變說明轉(zhuǎn)染成功，Western Blot鑒定顯示感染組細胞在94kd處有特異蛋白的表達，而正常組則沒有，與預(yù)期結(jié)果一致，進一步證明轉(zhuǎn)染成功。收集轉(zhuǎn)染后的細胞上清獲得第一代重組病毒粒子，并成功擴增病毒至第三代重組病毒粒子，通過空斑實驗計算出第三代病毒滴度為4×107PFU/ml。蛋白表達條件優(yōu)化在24孔板上進行，得到優(yōu)化條件為感染復(fù)數(shù)MOI=8，接種72h后收集蛋白。單層靜止培養(yǎng)的Sf9細胞成功馴化為懸浮旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，適用于后期蛋白表達。第三代重組病毒粒子感染復(fù)數(shù)MOI=8感染600ml懸浮旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)昆蟲細胞Sf9，病毒接種后72h收集蛋白，成功收獲全部培養(yǎng)上清及細胞。采用蛋白純化儀器AKTApurifier UPC10純化培養(yǎng)上清及細胞內(nèi)的蛋白，培養(yǎng)上清中蛋白純化條件：10mM，20mM咪唑洗滌，200mM洗脫；細胞內(nèi)蛋白純化條件：2.5mM，5mM咪唑洗滌，200mM洗脫。大量蛋白純化后獲得蛋白濃度為：培養(yǎng)上清中蛋白樣品濃度約0.15μg/μl，約1.5ml，細胞內(nèi)蛋白樣品濃度約0.35μg/μl,約2ml。 結(jié)論成功獲得大量的重組桿狀病毒以及大量的蛋白，為后續(xù)實驗奠定了堅實的基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：IL-6受體 桿狀病毒表達系統(tǒng) 蛋白純化
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R392
【目錄】：

• 中英文縮略詞對照表5-7
• 摘要7-9
• ABSTRACT9-12
• 前言12-14
• 材料與方法14-34
• 結(jié)果34-37
• 討論37-40
• 結(jié)論40
• 參考文獻40-43
• 附錄一 部分試劑配方43-47
• 附錄二 個人簡歷47-49
• 附錄三 致謝49-50
• 附錄四 綜述50-60
• 文獻56-60

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 Lydia Giannitrapani;Maurizio Soresi;Daniele Balasus;Anna Licata;Giuseppe Montalto;;Genetic association of interleukin-6 polymorphism (-174 G/C) with chronic liver diseases and hepatocellular carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2013年16期

  本文關(guān)鍵詞：IL-6受體融合蛋白的表達及初步鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：414522