本文關(guān)鍵詞：中華按蚊kdr基因突變檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：中華按蚊（Anopheles sinensis）在我國(guó)分布廣泛，是間日瘧和馬來(lái)絲蟲(chóng)病傳播的重要媒介。以往的研究發(fā)現(xiàn)中華按蚊具有家、野兩棲且偏嗜吸動(dòng)物血的習(xí)性，其瘧疾傳播能量較弱。然而最近相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道顯示我國(guó)中部地區(qū)的中華按蚊瘧疾傳播能量較上世紀(jì)有明顯提升。作為我國(guó)中部地區(qū)目前最主要的瘧疾傳播媒介，中華按蚊在當(dāng)?shù)丿懠部刂浦械闹匾匀找媸艿街匾暋?媒介防制是瘧疾控制階段和消除階段的關(guān)鍵措施之一。在我國(guó)瘧疾控制階段，主要的媒介防制措施是在瘧疾流行區(qū)大范圍采用殺蟲(chóng)劑室內(nèi)滯留噴灑或藥物浸泡蚊帳為主的成蚊防制方法。隨著殺蟲(chóng)劑的廣泛應(yīng)用，昆蟲(chóng)對(duì)殺蟲(chóng)劑的抗性迅速在全球范圍內(nèi)擴(kuò)散。昆蟲(chóng)對(duì)殺蟲(chóng)劑抗性的機(jī)制一直是人們關(guān)注的重要問(wèn)題，越來(lái)越多的研究集中于對(duì)殺蟲(chóng)劑抗性機(jī)理的研究，昆蟲(chóng)對(duì)殺蟲(chóng)劑的抗性機(jī)制主要有四種：靶標(biāo)抗性、代謝抗性、行為抗性和表皮化抗性，其中靶標(biāo)抗性和代謝抗性在昆蟲(chóng)抗藥性的形成中起著重要作用，即：昆蟲(chóng)神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)殺蟲(chóng)劑靶位點(diǎn)敏感性的改變和解毒酶表達(dá)水平或活性的改變。擊倒抗性（knockdown resistance, kdr）是靶標(biāo)抗性中的重要代表。一系列的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑的主要作用機(jī)理是通過(guò)鈉離子通道（voltage gated sodium channel, VGSC）的持續(xù)活化使昆蟲(chóng)經(jīng)由興奮、痙攣到麻痹而導(dǎo)致昆蟲(chóng)死亡。鈉離子通道蛋白第二結(jié)構(gòu)域S6區(qū)段編碼的氨基酸序列的改變，即kdr基因L1014位點(diǎn)突變，是引起昆蟲(chóng)對(duì)殺蟲(chóng)劑抗藥性的關(guān)鍵。 自Kdr基因L1014位點(diǎn)的突變?cè)诩蚁�、蟑螂等昆蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)后，又相繼在岡比亞按蚊、庫(kù)蚊中發(fā)現(xiàn)其kdr基因L1014位點(diǎn)存在類似的突變。2007年，Kim H等報(bào)道鑒定了中華按蚊kdr基因存在L1014F和L1014C突變類型，kdr基因突變后的中華按蚊對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑的敏感性下降，2011年武松等報(bào)道了我國(guó)中華按蚊kdr基因也存在L1014F和L1014C突變。 在我國(guó)進(jìn)入瘧疾消除階段后，主要的媒介防制措施是對(duì)出現(xiàn)瘧疾病例疫點(diǎn)采用殺蟲(chóng)劑室內(nèi)滯留噴灑方法來(lái)阻斷可能的瘧疾傳播。目前在疫點(diǎn)媒介防制中應(yīng)用最為廣泛的殺蟲(chóng)劑仍是擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑。而在媒介防制措施中選擇有效的殺蟲(chóng)劑依賴于對(duì)媒介生物抗藥性水平的了解，因此不同地區(qū)的蚊蟲(chóng)擊倒抗性相關(guān)基因頻率可以為媒介防止措施提供重要的科學(xué)依據(jù)。關(guān)于檢測(cè)kdr突變的方法較多，等位基因特異性PCR（AS-PCR）是最早建立的kdr突變檢測(cè)方法，該方法具有簡(jiǎn)單易于操作的優(yōu)點(diǎn)，但敏感性和特異性較低；SSOP-ELISA、HOLA和PCR-Dot等方法與AS-PCR相比在敏感性和特異性上有一定的提高，但操作步驟繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)達(dá)5～18小時(shí)，因此難以在現(xiàn)場(chǎng)媒介監(jiān)測(cè)中推廣應(yīng)用。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的HRM、FRET/MCA、PCR elongation熒光法等也因儀器設(shè)備昂貴或操作繁瑣等原因受到限制。2012年Athanase等報(bào)道了AS-LAMP用于檢測(cè)岡比亞按蚊kdr的突變，雖然簡(jiǎn)單方便省時(shí)，但引物設(shè)計(jì)困難，而且敏感性和特異性也不盡如人意。上述這些方法主要用于其他蚊種的kdr突變檢測(cè)，目前報(bào)道的中華按蚊kdr突變檢測(cè)方法僅有AS-PCR和rtPASA法，而這兩種方法敏感性和特異性均存在不足，容易漏檢錯(cuò)檢。 為解決上述問(wèn)題，本研究擬根據(jù)中華按蚊kdr基因L1014F和L1014C兩種常見(jiàn)突變型，建立了2種新的可用于中華按蚊kdr基因L1014位點(diǎn)突變檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，并與經(jīng)典的kdr基因突變檢測(cè)方法AS-PCR進(jìn)行比較，還通過(guò)對(duì)現(xiàn)場(chǎng)中華按蚊樣本的檢測(cè)評(píng)估其現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用價(jià)值。研究包括四部分： 第一部分 TaqMan-MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)中華按蚊kdr基因突變的研究 方法：根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的中華按蚊鈉離子通道蛋白（VGSC）基因序列（Genbank登錄號(hào)：GI84646709）及其L1014位點(diǎn)的常見(jiàn)突變類型，設(shè)計(jì)一對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增引物和三條TaqMan-MGB探針。用Fast Tissue-to-PCR Kit試劑盒提取的中華按蚊江蘇實(shí)驗(yàn)株樣本gDNA為模板，對(duì)反應(yīng)體系中的引物濃度、探針濃度、DNA模板量和反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。 結(jié)果：采用根據(jù)中華按蚊鈉離子通道（VGSC）基因序列及其L1014位點(diǎn)突變類型設(shè)計(jì)的一對(duì)引物和三條TaqMan-MGB探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，經(jīng)優(yōu)化后的反應(yīng)體系為：總反應(yīng)體系10μL，其中Thermo Scientific Maxima ProbeqPCR Master Mix（2×）5μL，引物濃度500nmol/L，TaqMan-MGB探針濃度500nmol/L，模板2μL。反應(yīng)條件采用兩步法，即：50℃2min，95℃預(yù)變性10min；95℃變性15s，60℃退火30s，40個(gè)循環(huán)；40℃冷卻10s；用優(yōu)化后的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件對(duì)突變型和野生型進(jìn)行單管三重探針檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序完全一致，但僅能區(qū)分是否發(fā)生突變，不能鑒別具體的突變類型；對(duì)六種不同的kdr基因型進(jìn)行雙管兩重探針檢測(cè)，可對(duì)具體的突變類型進(jìn)行鑒別，檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果也完全符合。 第二部分 Allglo探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)中華按蚊kdr基因的研究 方法：根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的中華按蚊鈉離子通道蛋白（VGSC）基因序列（Genbank登錄號(hào)：GI84646709）及其L1014位點(diǎn)的常見(jiàn)突變類型，設(shè)計(jì)一對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增引物和三條Allglo探針。用Fast Tissue-to-PCR Kit試劑盒提取的中華按蚊江蘇實(shí)驗(yàn)株樣本gDNA為模板，對(duì)引物濃度、探針濃度、DNA模板量和退火溫度等進(jìn)行優(yōu)化。 結(jié)果：采用根據(jù)中華按蚊鈉離子通道（VGSC）基因序列及其L1014位點(diǎn)突變類型設(shè)計(jì)的一對(duì)引物和三條Allglo探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，經(jīng)優(yōu)化后的反應(yīng)體系為：總反應(yīng)體系10μL，其中HR qPCR Probes Master（2×）5μL，引物濃度600nmol/L，Allglo探針濃度600nmol/L，模板2μL。反應(yīng)條件采用兩步法，即：95℃預(yù)變性10min；95℃變性15s，60℃退火30s，40個(gè)循環(huán)；40℃冷卻10s。用優(yōu)化后的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件采用單管三重探針?lè)ǹ梢詫?duì)六種不同的kdr基因型進(jìn)行鑒別，不需要進(jìn)一步進(jìn)行雙管兩重探針檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果完全符合。 第三部分 三種中華按蚊kdr基因突變檢測(cè)技術(shù)的比較 方法：用前述建立的TaqMan-MGB探針?lè)ê虯llglo探針?lè)�，與D. Zhong等報(bào)道的AS-PCR檢測(cè)方法，對(duì)163個(gè)經(jīng)測(cè)序證實(shí)的中華按蚊樣本和重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)kdr基因DNA模板進(jìn)行kdr基因L1014位點(diǎn)突變檢測(cè)，評(píng)估三種方法的準(zhǔn)確性、敏感性，并就成本、耗時(shí)等方面進(jìn)行綜合比較。 結(jié)果：同“金標(biāo)準(zhǔn)”DNA測(cè)序相比較，，Allglo探針的準(zhǔn)確率最高，錯(cuò)判和誤判最少，TaqMan-MGB的準(zhǔn)確率次之，略低于Allglo探針；AS-PCR的準(zhǔn)確率為三者中最差。敏感性的比較結(jié)果顯示TaqMan-MGB探針和Allglo探針均具有比較高的敏感性且兩種方法的敏感性比較接近，AS-PCR的敏感性相對(duì)較低。結(jié)合成本和耗時(shí)因素分析，“金標(biāo)準(zhǔn)”DNA測(cè)序的成本最高，TaqMan-MGB探針檢測(cè)法次之，Allglo探針檢測(cè)的成本較測(cè)序和TaqMan-MGB法有降低，AS-PCR的成本最低，但其準(zhǔn)確率也最差。綜合比較分析發(fā)現(xiàn)，Allglo探針?lè)ú粌H檢測(cè)準(zhǔn)確率較高，而且成本低、耗時(shí)短，因此更適用于現(xiàn)場(chǎng)中華按蚊kdr基因L1014位點(diǎn)突變的檢測(cè)。 第四部分 Allglo探針?lè)ㄓ糜诂F(xiàn)場(chǎng)中華按蚊kdr基因L1014位點(diǎn)突變的檢測(cè) 方法：利用前述已經(jīng)建立的Allglo探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)從我國(guó)中部不同省份不同地點(diǎn)采集的中華按蚊樣本進(jìn)行kdr基因檢測(cè)。并對(duì)中華按蚊kdr基因的突變頻率與文獻(xiàn)報(bào)道的采集地中華按蚊抗性水平進(jìn)行初步的比較分析。 結(jié)果：根據(jù)不同省份的中華按蚊kdr基因L1014位點(diǎn)突變的檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)河南、山東、浙江和江蘇等省的中華按蚊kdr基因L1014位點(diǎn)均存在很高的突變頻率。其中河南省的中華按蚊樣本kdr基因突變頻率為90.48%，浙江省的中華按蚊樣本kdr基因突變頻率為97.71%，山東省的中華按蚊樣本kdr基因突變頻率為90.63%，江蘇省的中華按蚊樣本kdr基因突變頻率為87.61%。只有湖北省的中華按蚊樣本kdr基因突變頻率較低為45.38%。這些省份的中華按蚊kdr基因較高的突變率可能與該地區(qū)中華按蚊較高的抗藥性有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：中華按蚊 擬除蟲(chóng)菊酯 擊倒抗性 突變 熒光定量PCR
【學(xué)位授予單位】：江蘇省血吸蟲(chóng)病防治研究所
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R384.1
【目錄】：

• 摘要6-10
• Abstract10-15
• 序言15-19
• 第一部分 TaqMan-MGB 探針實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測(cè)中華按蚊 kdr基因突變的研究19-35
• 第二部分 Allglo 探針實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測(cè)中華按蚊 kdr 基因的研究35-48
• 第三部分 三種中華按蚊 kdr 基因突變檢測(cè)技術(shù)的比較48-71
• 第四部分 Allglo 探針?lè)ㄓ糜诂F(xiàn)場(chǎng)中華按蚊 kdr 基因 L1014 位點(diǎn)突變的檢測(cè)71-77
• 結(jié)論77-78
• 參考文獻(xiàn)78-84
• 致謝84-85
• 綜述85-98
• 參考文獻(xiàn)93-98
• 附錄98-99
• 研究生在讀期間發(fā)表論文99

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：中華按蚊kdr基因突變檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：413743