發(fā)布時間：2017-05-31 18:08

  本文關(guān)鍵詞：布拉酵母預(yù)防腸炎沙門氏菌感染的機(jī)制研究及其堿性磷酸酶的重組表達(dá)與性質(zhì)分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：布拉酵母在臨床上主要用于防治大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、難辨梭菌、幽門螺桿菌、白假絲酵母和原蟲等病原體感染引起的疾病。同時,布拉酵母分泌的堿性磷酸酶(AP)能夠?qū)Ω锾m氏陰性菌LPS去磷酸化,而阻斷由LPS介導(dǎo)的下游信號通路。本研究一方面研究布拉酵母預(yù)防腸炎沙門氏菌感染的機(jī)理。另一方面克隆布拉酵母堿性磷酸酶(SBAP)基因,并實(shí)現(xiàn)其在畢赤酵母中重組分泌表達(dá),初步研究rAP對LPS去磷酸化作用,為該蛋白藥物治療LPS所致的疾病提供基礎(chǔ)。 1)為了探討布拉酵母預(yù)防腸炎沙門氏菌感染的機(jī)理,構(gòu)建經(jīng)布拉酵母預(yù)處理的小鼠腸炎沙門氏菌感染模型。在感染后監(jiān)測小鼠體重變化及腸炎沙門氏菌在肝臟和盲腸中的數(shù)量,掃描電鏡觀察布拉酵母對腸道微生物的吸附作用,HE染色觀察小鼠肝組織損傷情況。結(jié)果表明,感染后第11天,布拉酵母緩解由腸炎沙門氏菌感染所致的小鼠體重下降的現(xiàn)象(25.9g：22.3g)(p0.05)。在盲腸定植的腸炎沙門氏菌數(shù)由107cfu/g降低為105cfu/g,其在肝臟的數(shù)量由104cfu/g降低為4×102cfu/g。肝組織HE染色結(jié)果表明,布拉酵母能夠緩解由腸炎沙門氏菌感染所引起的中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤肝細(xì)胞所造成的肝損傷。 2)本試驗(yàn)通過酵母屬AP蛋白序列相似性比對,據(jù)得到保守位點(diǎn)設(shè)計兼并引物,克隆SBAP基因。構(gòu)建畢赤酵母甲醇誘導(dǎo)型表達(dá)載體pPICSAP,電轉(zhuǎn)畢赤酵母X-33,將篩選后表達(dá)重組AP(rAP)的重組酵母在200ml搖瓶水平放大誘導(dǎo)表達(dá),其發(fā)酵液上清用HisTrapHP柱純化。結(jié)果表明,成功克隆SBAP基因,其大小為1701bp,無內(nèi)含子,包含一個終止密碼子,GenBank編號為KF471017。 pPICSAP重組表達(dá)菌株在200ml搖瓶水平誘導(dǎo)表達(dá)120h時,rAP的濃度達(dá)到最大值為43.66mg/1.純化過程中確定洗脫緩沖液中咪唑最適濃度為250mM,洗脫峰經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳和Bandscale軟件分析,呈單一條帶,其純度達(dá)到90%以上。 3)本試驗(yàn)初步測定在二乙醇胺緩沖液中,Mg2+、EDTA、溫度和pH對rAP酶活性的影響,及在最佳酶活條件下測定rAP的比活。同時,在pH2-10的Tris-HCl緩沖液中,體外檢測rAP對LPS去磷酸化功效,及腹腔注射經(jīng)rAP去磷酸化后的LPS對小鼠血清中TNF-α表達(dá)水平的影響。結(jié)果表明,在二乙醇胺緩沖液中,rAP的最佳反應(yīng)條件是pH9.6,2mM Mg2+,溫度為60℃,且EDTA為rAP的強(qiáng)抑制劑,1mM的EDTA將rAP的酶活抑制到其活性的18.37%。rAP比活為9912U/mg,是先前研究中重組表達(dá)的小牛腸AP比活的3倍。rAP溫度穩(wěn)定性分析顯示其在37℃處理1h后,其酶活性仍維持在80%以上,但隨著溫度提高,酶活性逐漸降低,在100℃處理1h后,酶活性基本喪失。此外,在pH2-10的Tris-HCl緩沖液中,rAP對LPS均具有去磷酸化活性。經(jīng)rAP去磷酸化后的LPS與野生型的LPS相比,顯著減少了小鼠血清中TNF-α表達(dá)水平(55.16ng/1比64.24ng/1),(p0.01)。 綜上,布拉酵母能緩解腸炎沙門氏菌感染小鼠肝臟誘導(dǎo)的肝損傷。同時,本研究首次報道并克隆SBAP基因,實(shí)現(xiàn)其在畢赤酵母中高活性分泌表達(dá),建立rAP的Ni親和層析柱一步純化法,且rAP對LPS具有解毒功能。本研究獲得的rAP將為治療LPS所致的疾病提供有效的候選生物材料。
【關(guān)鍵詞】：布拉酵母 腸炎沙門氏菌 畢赤酵母 rAP 酶學(xué)性質(zhì) LPS TNF-α
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R378
【目錄】：

• 摘要2-4
• Abstract4-7
• 符號說明7-8
• 第一章 綜述8-20
• 1.1 布拉酵母概述8
• 1.2 布拉酵母益生機(jī)理研究進(jìn)展8-13
• 1.3 布拉酵母在疾病防治中的應(yīng)用研究進(jìn)展13-17
• 1.4 布拉酵母在飼料添加劑領(lǐng)域中的研究進(jìn)展17-20
• 第二章 布拉酵母預(yù)防腸炎沙門氏菌感染的機(jī)制研究20-30
• 2.1 引言20
• 2.2 試驗(yàn)材料20-22
• 2.3 方法22-24
• 2.4 結(jié)果24-28
• 2.5 討論28-30
• 第三章 布拉酵母堿性磷酸酶基因克隆及其在畢赤酵母中的分泌表達(dá)與純化30-61
• 3.1 引言30-31
• 3.2 試驗(yàn)材料31-36
• 3.3 方法36-50
• 3.4 結(jié)果50-59
• 3.5 討論59-61
• 第四章 rAP性質(zhì)分析61-69
• 4.1 引言61
• 4.2 試驗(yàn)材料61-62
• 4.3 試驗(yàn)方法62-65
• 4.4 結(jié)果65-68
• 4.5 討論68-69
• 參考文獻(xiàn)69-82
• 致謝82-83
• 碩士期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文83-84

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前7條

1 伍代朝;滕達(dá);王秀敏;戴華;王建華;;布拉酵母在飼料添加劑中的應(yīng)用[J];飼料研究;2013年12期

2 Fariborz Mansour-Ghanaei;Najaf Dehbashi;Kamyar Yazdanparast;Afshin Shafaghi;;Efficacy of saccharomyces boulardii with antibiotics in acute amoebiasis[J];World Journal of Gastroenterology;2003年08期

3 Stéphane M Schneider;Fernand Girard-Pipau;Jér(o|^)me Filippi;Xavier Hébuterne;Dominique Moyse;Gustavo Calle Hinojosa;Anne Pompei;Patrick Rampal;;Effects of Saccharomycesboulardiion fecal short-chain fatty acids and microflora in patients on long-term total enteral nutrition[J];World Journal of Gastroenterology;2005年39期

4 M Ponz-Sarvisé;J Rodríguez;A Viudez;A Chopitea;A Calvo;J García-Foncillas;I Gil-Bazo;;Epidermal growth factor receptor inhibitors in colorectal cancer treatment: What's new?[J];World Journal of Gastroenterology;2007年44期

5 Lynne V McFarland;;Systematic review and meta-analysis of Saccharomyces boulardii in adult patients[J];World Journal of Gastroenterology;2010年18期

6 伍代朝;滕達(dá);胡小媛;戴華;王建華;;布拉酵母防治病原微生物感染的機(jī)制及效果[J];中國微生態(tài)學(xué)雜志;2013年06期

7 Kriszta Molnár;嚶dám Vannay;Beáta Szebeni;Nóra Fanni Bánki;Erna Sziksz;嚶ron Cseh;Hajnalka Gy銉rffy;Péter László Lakatos;Mária Papp;András Arató;Gábor Veres;;Intestinal alkaline phosphatase in the colonic mucosa of children with inflammatory bowel disease[J];World Journal of Gastroenterology;2012年25期

  本文關(guān)鍵詞：布拉酵母預(yù)防腸炎沙門氏菌感染的機(jī)制研究及其堿性磷酸酶的重組表達(dá)與性質(zhì)分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：410235