本文關(guān)鍵詞：人巨細(xì)胞病毒PP65基因的原核表達(dá)及初步應(yīng)用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)是皰疹病毒科中最大的一種病毒。HCMV在人群中感染廣泛,在正常人群中通常造成無(wú)癥狀感染或持續(xù)感染,但在免疫缺陷患者中可引起嚴(yán)重后果。孕婦感染HCMV后,容易經(jīng)母嬰途徑傳播給胎兒,造成胎兒畸形、智力低下、神經(jīng)系統(tǒng)異常。因此孕婦的產(chǎn)前檢測(cè)意義重大。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)是一種最常用的檢測(cè)HCMV抗體的方法。然而,大多ELISA商品試劑盒所用的是單表位的重組蛋白抗原。為提高HCMV抗體檢測(cè)的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性,推薦用雙表位或多表位的重組蛋白試劑盒來(lái)診斷HCMV感染。HCMV被膜磷蛋白pp65表明有T細(xì)胞和B細(xì)胞表位,可誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生。我們?cè)噲D通過(guò)基因重組技術(shù)制備HCMV pp65重組蛋白,并將其用作HCMV感染的診斷抗原。 研究目的：通過(guò)基因重組制備HCMV pp65重組蛋白,并將其用于人巨細(xì)胞病毒感染的免疫學(xué)診斷�！� 研究方法：根據(jù)GenBank中公布的HCMV PP65基因序列,自行設(shè)計(jì)一對(duì)引物,PCR擴(kuò)增目的基因片段,然后對(duì)純化的PCR產(chǎn)物及pGEX-4T-l載體質(zhì)粒用EcoRI和BamHI兩種限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切并純化回收,連接回收產(chǎn)物,構(gòu)建pGEX-4T-1/PP65重組質(zhì)粒,對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。將pGEX-4T-1/PP65重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主大腸桿菌BL21(DE3),而后用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)驗(yàn)證其表達(dá)產(chǎn)物后,用親和層析技術(shù)對(duì)上清中的融合蛋白進(jìn)行純化,用ELISA間接法對(duì)已純化的GST/pp65融合蛋白的特性進(jìn)行鑒定。純化的GST/pp65用做ELISA診斷抗原檢測(cè)423例人血清,并與商品試劑盒做了比較。 研究結(jié)果：通過(guò)PCR成功擴(kuò)增PP65基因；成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/PP65;成功表達(dá)GST/pp65重組蛋白；GST/pp65重組蛋白與HCMV抗體結(jié)合的特異性較好。 研究結(jié)論：GST/pp65重組蛋白能用作HCMV診斷抗原。
【關(guān)鍵詞】：人巨細(xì)胞病毒 GST/pp65重組蛋白 克隆 表達(dá) 純化 ELISA
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 摘要2-3
• Abstract3-8
• 符號(hào)說(shuō)明8-10
• 綜述10-17
• 參考文獻(xiàn)14-17
• 前言17-19
• 參考文獻(xiàn)17-19
• 第一部分 PP65基因克隆與原核表達(dá)載體的構(gòu)建19-35
• 材料與方法19-33
• 1.材料19-22
• 1.1 毒株、菌株及載體19-20
• 1.2 試劑與設(shè)備20
• 1.3 引物合成與DNA測(cè)序20
• 1.4 主要儀器設(shè)備20
• 1.5 試劑盒20
• 1.6 主要試劑配方20-22
• 2.方法22-28
• 2.1 HCMV病毒的收集22-23
• 2.1.1 HELF細(xì)胞的復(fù)蘇與傳代22
• 2.1.2 HCMV病毒的培養(yǎng)22-23
• 2.2 HCMV病毒DNA模板的提取23
• 2.3 pGEX-4T-1/PP65重組質(zhì)粒的構(gòu)建23-26
• 2.3.1 人巨細(xì)胞病毒表面抗原PP65基因的PCR擴(kuò)增23-24
• 2.3.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳24
• 2.3.3 pGEX-4T-1載體質(zhì)粒DNA的提取24-25
• 2.3.4 PCR純化產(chǎn)物與載體質(zhì)粒DNA的雙酶切及純化回收25-26
• 2.3.5 PP65和pGEX-4T-1的連接26
• 2.4 重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/PP65的轉(zhuǎn)化26-27
• 2.4.1 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備26-27
• 2.4.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌27
• 2.5 pGEX-4T-1/PP65重組質(zhì)粒的鑒定27-28
• 2.5.1 pGEX-4T-1/PP65重組質(zhì)粒DNA的提取27
• 2.5.2 重組質(zhì)粒的PCR與雙酶切鑒定27-28
• 2.5.3 pGEX-4T-1/PP65重組質(zhì)粒DNA的測(cè)序鑒定28
• 2.5.4 pGEX-4T-1/PP65重組質(zhì)粒的保種28
• 3.結(jié)果28-33
• 3.1 正常的HELF細(xì)胞與產(chǎn)生細(xì)胞病變效應(yīng)的HELF細(xì)胞28-29
• 3.2 PCR擴(kuò)增PP65目的基因片段29-30
• 3.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建30-31
• 3.4 原核表達(dá)載體pGEX-4T-1/PP65的鑒定31-32
• 3.5 重組質(zhì)粒測(cè)序鑒定32
• 3.6 目的氨基酸序列的抗原性預(yù)測(cè)32-33
• 4.討論33
• 參考文獻(xiàn)33-35
• 第二部分 pp65蛋白的可溶性表達(dá)及鑒定35-51
• 1.材料35-38
• 1.1 生物材料及來(lái)源35
• 1.2 生化試劑及部分配制方法35-38
• 1.3 主要儀器設(shè)備38
• 1.4 試劑盒38
• 2.方法38-43
• 2.1 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主菌38-39
• 2.1.1 大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)的制備38-39
• 2.1.2 pGEX-4T-1/PP65重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主菌39
• 2.1.3 pGEX-4T-1載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主菌39
• 2.2 pGEX-4T-1/PP65重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)39-40
• 2.2.1 少量誘導(dǎo)39
• 2.2.2 大量誘導(dǎo)39-40
• 2.3 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測(cè)40
• 2.3.1 樣品的處理40
• 2.3.2 SDS聚丙烯酰胺凝膠的配制40
• 2.3.3 電泳檢測(cè)40
• 2.4 表達(dá)產(chǎn)物的定位40-41
• 2.5 表達(dá)產(chǎn)物的GST蛋白純化柱純化41
• 2.6 間接ELISA法檢測(cè)GST/pp65融合蛋白活性41-42
• 2.7 Western Blot檢測(cè)GST/pp65融合蛋白活性42-43
• 2.8 GST/pp65蛋白和GST/gB蛋白混合抗原的特性鑒定43
• 3.結(jié)果43-49
• 3.1 蛋白誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳檢測(cè)43-45
• 3.1.1 少量誘導(dǎo)SDS-PAGE電泳檢測(cè)43-44
• 3.1.2 大量誘導(dǎo)SDS-PAGE電泳44-45
• 3.2 表達(dá)產(chǎn)物的純化45-46
• 3.3 GST/pp65融合蛋白和GST蛋白的特性鑒定46-48
• 3.4 GST/pp65蛋白和GST/gB蛋白混合抗原的特性鑒定48-49
• 3.5 GST/pp65蛋白的Western Blot結(jié)果49
• 4.討論49-50
• 參考文獻(xiàn)50-51
• 第三部分 pp65ELISA試劑盒的初步應(yīng)用51-55
• 1.血清與材料51
• 2.方法51-52
• 2.1 自制pp65 ELISA試劑盒51
• 2.2 自制pp65+gB ELISA試劑盒51
• 2.3 臨床檢測(cè)51-52
• 2.4 自制試劑盒特異性檢測(cè)52
• 3.試驗(yàn)結(jié)果52-53
• 4.討論53
• 參考文獻(xiàn)53-55
• 致謝55-56

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 丁華;黃麗萍;劉和錄;韓杰輝;梁巧玲;於艷霞;;孕婦及其新生兒感染HCMV-IgG、IgM的檢測(cè)分析[J];中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志;2009年05期

  本文關(guān)鍵詞：人巨細(xì)胞病毒PP65基因的原核表達(dá)及初步應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：409729