本文關(guān)鍵詞：糞腸球菌噬菌體IME-EF1的分離鑒定及其裂解酶的表達(dá)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：隨著抗生素的濫用現(xiàn)象日益嚴(yán)重，細(xì)菌的耐藥性問題日益加劇，新抗生素的研發(fā)速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)趕不上耐藥菌的產(chǎn)生速度，尋找新的抗菌制劑刻不容緩。而噬菌體及其裂解酶因其高效的殺菌能力及高度的宿主專一性而成為新一代抗菌制劑的候選之一，對(duì)于噬菌體及其裂解酶的研究在近些年被許多研究者提上日程。糞腸球菌是普遍存在于人或動(dòng)物腸道、口腔及生殖道內(nèi)的條件致病菌，可引起人的心內(nèi)膜炎、菌血癥、泌尿道感染及腦膜炎等疾病。在需氧革蘭氏陽性菌導(dǎo)致的院內(nèi)感染中，其致病率僅次于葡萄球菌，而多重耐藥糞腸球菌所引起的疾病已經(jīng)對(duì)人類健康造成極大威脅。 本研究就目前糞腸球菌的嚴(yán)重耐藥性現(xiàn)狀，利用臨床分離的多重耐藥菌，從醫(yī)院污水中分離到一株可廣泛裂解耐藥糞腸球菌的噬菌體IME-EF1，分析研究其生物學(xué)特性并進(jìn)行全基因組測(cè)序；克隆表達(dá)噬菌體裂解酶，驗(yàn)證其裂解活性及測(cè)定裂解譜；構(gòu)建小鼠腹部糞腸球菌感染模型對(duì)噬菌體IME-EF1及其裂解酶的治療效果進(jìn)行評(píng)估。方法： 以臨床分離的多重耐藥糞腸球菌EF002為指示菌，采用噬菌斑實(shí)驗(yàn)從醫(yī)院污水中分離噬菌體；利用雙層平板培養(yǎng)法測(cè)定噬菌體IME-EF1效價(jià),同時(shí)測(cè)定噬菌體的最佳感染復(fù)數(shù)及一步生長(zhǎng)曲線；負(fù)染法透射電鏡觀察噬菌體形態(tài)；蛋白酶K/SDS法提取噬菌體基因組并酶切后電泳分析；ION TORRENT高通量測(cè)序儀測(cè)定噬菌體IME-EF1全基因組序列。 PCR擴(kuò)增噬菌體IME-EF1裂解酶基因，克隆到pColdI表達(dá)載體進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；采用點(diǎn)滴法與濁度法驗(yàn)證蛋白裂解活性及測(cè)定裂解譜；ELISA和Western blotting分析驗(yàn)證裂解酶蛋白表達(dá)與否及與敏感菌是否特異性結(jié)合。 給小鼠腹部注射最小致死量的糞腸球菌EF002，感染一段時(shí)間后，分組腹部注射噬菌體IME-EF1或其裂解酶進(jìn)行治療，記錄小鼠死亡率及血液內(nèi)細(xì)菌量，判斷噬菌體及其裂解酶的治療效果。 結(jié)果： 成功分離出一株噬菌體IME-EF1，該噬菌體能夠裂解多株臨床分離的糞腸球菌；電鏡觀察呈蝌蚪形，，最佳感染復(fù)數(shù)為1；通過繪制一步生長(zhǎng)曲線證明該噬菌體感染后的潛伏期為25min，爆發(fā)期35min，裂解量60pfu。 成功表達(dá)噬菌體裂解酶蛋白Lysin-EF2。該蛋白能夠裂解實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的所有糞腸球菌，包括2株耐萬古霉素糞腸球菌；可與敏感菌特異性緊密結(jié)合。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明噬菌體IME-EF1及其裂解酶Lysin-EF2對(duì)于糞腸球菌所導(dǎo)致的感染具有較好的治療效果，裂解酶治療效果優(yōu)于噬菌體；而在感染后及時(shí)有效的給藥對(duì)于降低小鼠死亡率有一定意義。 結(jié)論： 隨著糞腸球菌耐藥性日趨嚴(yán)重，積極探索不依賴抗生素的治療方法勢(shì)在必行。研究結(jié)果表明利用臨床分離的耐藥糞腸球菌分離裂解性噬菌體，表達(dá)重組噬菌體裂解酶，并用于治療細(xì)菌感染性疾病的方法是可行的，上述研究為耐藥糞腸球菌的抗生素替代療法打下了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：糞腸球菌 噬菌體 裂解酶 噬菌體治療
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R378.1
【目錄】：

• 縮略詞表6-8
• 摘要8-10
• Abstract10-13
• 前言13-18
• 1 糞腸球菌及其耐藥現(xiàn)狀13-14
• 2 噬菌體及其裂解酶的研究進(jìn)展14-17
• 3 本研究的內(nèi)容及方案17-18
• 第一部分 糞腸球菌噬菌體IME-EF1的分離鑒定及其生物學(xué)特性研究18-33
• 1 引言18-19
• 2 材料和方法19-25
• 3 結(jié)果25-30
• 4 討論30-33
• 第二部分 噬菌體裂解酶 Lysin-EF2 的表達(dá)與活性檢測(cè)33-54
• 1 引言33
• 2 材料和方法33-46
• 3 結(jié)果46-53
• 4 討論53-54
• 第三部分 建立小鼠腹部感染治療模型54-59
• 1 引言54
• 2 材料與方法54-56
• 3 結(jié)果56-57
• 4 討論57-59
• 結(jié)論59-60
• 參考文獻(xiàn)60-64
• 附錄64-69
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷69-70
• 致謝70-71
• 綜述71-80
• 參考文獻(xiàn)77-80

【共引文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：糞腸球菌噬菌體IME-EF1的分離鑒定及其裂解酶的表達(dá)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：408059