本文關(guān)鍵詞：磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白低表達(dá)對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)的影響及分子機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的 炎癥(inflammation)在人類多種重要疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中起著關(guān)鍵的作用。巨噬細(xì)胞(macrophage)作為一種免疫細(xì)胞，在炎癥的多個(gè)環(huán)節(jié)起到重要作用。核轉(zhuǎn)錄因子κB(nucleus factor kappa-B, NFκB)是巨噬細(xì)胞參與的炎癥信號(hào)通路中最重要的轉(zhuǎn)錄因子之一，它的激活能引起多種炎癥因子如白細(xì)胞介素(interleukin)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)等表達(dá)升高。磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(phospholipidtransfer protein, PLTP)參與炎癥發(fā)生發(fā)展過程，PLTP能結(jié)合、轉(zhuǎn)運(yùn)以及中和脂多糖(lip-polysaccharide, LPS)，PLTP缺乏小鼠(PLTP-/-)在致死劑量的內(nèi)毒素血癥時(shí)血漿炎癥因子表達(dá)升高，器官損傷加重，死亡率增加。該過程中高表達(dá)的炎癥因子均受NFκB調(diào)控，且在巨噬細(xì)胞內(nèi)均有表達(dá)，提示上述炎癥因子表達(dá)升高很可能與巨噬細(xì)胞NFκB激活相關(guān)。本研究擬采用多種巨噬細(xì)胞為模型，探討PLTP低表達(dá)或不表達(dá)對(duì)LPS刺激的影響及可能的分子機(jī)制。 方法 1、小鼠繁育，PLTP敲除雜合子為親代，繁育出子代經(jīng)基因型鑒定得到純合子PLTP-/-及同窩出生野生型小鼠(wild type mic, WT)。從中選取雄性WT和PLTP-/-各8只。 2、小鼠第八周齡時(shí)，提取LPS誘導(dǎo)的腹腔巨噬細(xì)胞，分離骨髓進(jìn)行原代培養(yǎng)，并添加含集落刺激因子的L cell培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)。培養(yǎng)十天左右，骨髓源性巨噬細(xì)胞(bone marrow derived macrophage, BMDM)誘導(dǎo)完成。 3、培養(yǎng)巨噬細(xì)胞模型RAW264.7、人臍靜脈上皮細(xì)胞(Human umbilicalvein epithelial cell, HUVEC)，分為三組分別為空白組(標(biāo)記為blank)、對(duì)照組(標(biāo)記為Control siRNA)和實(shí)驗(yàn)組(標(biāo)記為PLTP siRNA)。 4、將WT和PLTP-/-BMDM兩種細(xì)胞分別在不同的時(shí)間段(分別為0.5h,1h,2h)給予LPS(濃度為200ng/ml)刺激。 5、將PLTP siRNA RAW264.7在不同的時(shí)間段(分別為0.5h,1h,2h)給予LPS(濃度為200ng/ml)刺激。 6、將PLTP siRNA HUVEC在不同的時(shí)間段(分別為0.5h,1h,2h)給予TNF-α(濃度為20ng/ml)刺激。 7、Western Blot檢測與NFκB信號(hào)通路相關(guān)蛋白；NFκB活性亞單位p65、胞漿內(nèi)抑制亞單位IκB-α、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(Signal transducers and activators oftranscription3, STAT3)及其磷酸化蛋白(pSTAT3)、轉(zhuǎn)錄生長因子激酶1(transformgrowth factor activated kinase1, TAK1)及其磷酸化蛋白(pTAK1)，核蛋白內(nèi)參H3以及胞漿蛋白內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH)。 8、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-Time-PCR)技術(shù)檢測細(xì)胞中相關(guān)炎癥因子IL-6、 IL-10、 TNF-α和干擾素-γ(interferon-γ, IFN-γ)mRNA的表達(dá)。 9、酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immuno sorbent assay)檢測BNDM培養(yǎng)基中IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ含量。 10、免疫熒光染色技術(shù)檢測核蛋白p65轉(zhuǎn)位。 結(jié)果 1、LPS刺激下腹腔巨噬細(xì)胞及原代巨噬細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果； (1)PLTP-/-腹腔巨噬細(xì)胞炎癥因子IL-10、IFN-γ、TNF-α和IL-6的mRNA的表達(dá)均較WT顯著升高(P0.01)。 (2)PLTP-/-BMDM炎癥因子的mRNA表達(dá)較WT部分有所升高： IL-10、TNF-α和IL-6升高(P0.05)， IFN-γ無明顯差異(P0.05)。 (3)PLTP-/-BMDM培養(yǎng)基中炎癥因子表達(dá)較WT均有所升高： IL-10和TNF-α升高198.5!(P0.05)， IL-6升高23.4!(P0.05)， IFN-γ無明顯差異(P0.05)。 2、 LPS刺激下WT和PLTP-/-BMDM及LPS刺激下PLTP konckdownRAW264.7p65和IκB-α結(jié)果； (1)BMDM核內(nèi)p65含量， PLTP-/-較WT增加30.5!(P0.05)。 (2)BMDM胞漿內(nèi)IκB-α含量， PLTP-/-較WT減少34!(P0.05)。 (3)RAW264.7核內(nèi)p65含量， PLTP siRNA組較control siRNA組增加200!(P0.05)。 (4)RAW264.7胞漿內(nèi)IκB-α含量，PLTP siRNA組較control siRNA組減少43!(P0.02)。 3、 TNF-α誘導(dǎo)的HUVEC p65和IκB-α結(jié)果 (1)HUVEC核內(nèi)p65含量， PLTP siRNA組較Control siRNA組增加54!(P0.05)。 (2)HUVEC胞漿內(nèi)IκB-α含量，PLTP siRNA組較Control siRNA組減少351.2!(P0.05)。 4、 LPS刺激下PLTP konckdown RAW264.7細(xì)胞120min和TNF-α刺激的PLTP konckdown HUVEC細(xì)胞120min時(shí)， pTAK1和TAK1蛋白表達(dá)結(jié)果； (1)在PLTP knockdown RAW264.7細(xì)胞中PLTP siRNA組較siRNA組在120min時(shí)增加了150!(P0.05)。 (2)在PLTP knockdown HUVEC細(xì)胞中，， PLTP siRNA組較siRNA組在120min時(shí)增加了3倍(P=0.05) 5、在加入格列苯脲后LPS誘導(dǎo)WT和PLTP-/-BMDM60min時(shí)pSTAT3蛋白結(jié)果； 在PLTP存在的情況下，pSTAT3的核內(nèi)水平未發(fā)現(xiàn)明顯增加，說明在本實(shí)驗(yàn)中未觀察到由巨噬細(xì)胞自身分泌的PLTP激活A(yù)BCA1-pSTAT3的現(xiàn)象。 6、 LPS誘導(dǎo)的WT和PLTP-/-BMDM、 LPS誘導(dǎo)的PLTP knockdownRAW264.7細(xì)胞和TNF-α誘導(dǎo)的PLTP konckdown RAW264.7細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果； (1)PLTP-/-BMDM較WT BMDM p65核轉(zhuǎn)位明顯增加。 (2)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞PLTP siRNA組較control siRNA組明顯增加。 (3)TNF-α誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞PLTP siRNA組較control siRNA組明顯增加。 結(jié)論 (1)PLTP缺乏誘導(dǎo)的PDM和BMDM在LPS刺激下炎癥因子表達(dá)升高。 (2)PLTP缺乏增強(qiáng)了NFκB活性亞單位p65核轉(zhuǎn)位水平。 (3)RAW264.7和HUVEC中NFκB活性亞單位p65核轉(zhuǎn)位水平增強(qiáng)可能與TAK1磷酸化作用有關(guān)
【關(guān)鍵詞】：磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 炎癥 核轉(zhuǎn)錄因子κB 基因敲除小鼠
【學(xué)位授予單位】：泰山醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R363
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• ABSTRACT8-12
• 符號(hào)說明12-13
• 前言13-17
• 材料與方法17-43
• 結(jié)果43-45
• 討論45-48
• 結(jié)論48-49
• 附圖49-56
• 參考文獻(xiàn)56-60
• 綜述60-72
• 參考文獻(xiàn)67-72
• 致謝72

【共引文獻(xiàn)】

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2 田

本文編號(hào)：407321