本文關鍵詞：磷脂轉運蛋白低表達對巨噬細胞炎癥因子的表達的影響及分子機制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的 炎癥(inflammation)在人類多種重要疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中起著關鍵的作用。巨噬細胞(macrophage)作為一種免疫細胞，在炎癥的多個環(huán)節(jié)起到重要作用。核轉錄因子κB(nucleus factor kappa-B, NFκB)是巨噬細胞參與的炎癥信號通路中最重要的轉錄因子之一，它的激活能引起多種炎癥因子如白細胞介素(interleukin)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)等表達升高。磷脂轉運蛋白(phospholipidtransfer protein, PLTP)參與炎癥發(fā)生發(fā)展過程，PLTP能結合、轉運以及中和脂多糖(lip-polysaccharide, LPS)，PLTP缺乏小鼠(PLTP-/-)在致死劑量的內毒素血癥時血漿炎癥因子表達升高，器官損傷加重，死亡率增加。該過程中高表達的炎癥因子均受NFκB調控，且在巨噬細胞內均有表達，提示上述炎癥因子表達升高很可能與巨噬細胞NFκB激活相關。本研究擬采用多種巨噬細胞為模型，探討PLTP低表達或不表達對LPS刺激的影響及可能的分子機制。 方法 1、小鼠繁育，PLTP敲除雜合子為親代，繁育出子代經基因型鑒定得到純合子PLTP-/-及同窩出生野生型小鼠(wild type mic, WT)。從中選取雄性WT和PLTP-/-各8只。 2、小鼠第八周齡時，提取LPS誘導的腹腔巨噬細胞，分離骨髓進行原代培養(yǎng)，并添加含集落刺激因子的L cell培養(yǎng)基進行誘導。培養(yǎng)十天左右，骨髓源性巨噬細胞(bone marrow derived macrophage, BMDM)誘導完成。 3、培養(yǎng)巨噬細胞模型RAW264.7、人臍靜脈上皮細胞(Human umbilicalvein epithelial cell, HUVEC)，分為三組分別為空白組(標記為blank)、對照組(標記為Control siRNA)和實驗組(標記為PLTP siRNA)。 4、將WT和PLTP-/-BMDM兩種細胞分別在不同的時間段(分別為0.5h,1h,2h)給予LPS(濃度為200ng/ml)刺激。 5、將PLTP siRNA RAW264.7在不同的時間段(分別為0.5h,1h,2h)給予LPS(濃度為200ng/ml)刺激。 6、將PLTP siRNA HUVEC在不同的時間段(分別為0.5h,1h,2h)給予TNF-α(濃度為20ng/ml)刺激。 7、Western Blot檢測與NFκB信號通路相關蛋白；NFκB活性亞單位p65、胞漿內抑制亞單位IκB-α、信號轉導及轉錄激活因子3(Signal transducers and activators oftranscription3, STAT3)及其磷酸化蛋白(pSTAT3)、轉錄生長因子激酶1(transformgrowth factor activated kinase1, TAK1)及其磷酸化蛋白(pTAK1)，核蛋白內參H3以及胞漿蛋白內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH)。 8、實時熒光定量PCR(Real-Time-PCR)技術檢測細胞中相關炎癥因子IL-6、 IL-10、 TNF-α和干擾素-γ(interferon-γ, IFN-γ)mRNA的表達。 9、酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immuno sorbent assay)檢測BNDM培養(yǎng)基中IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ含量。 10、免疫熒光染色技術檢測核蛋白p65轉位。 結果 1、LPS刺激下腹腔巨噬細胞及原代巨噬細胞炎癥因子表達的實驗結果； (1)PLTP-/-腹腔巨噬細胞炎癥因子IL-10、IFN-γ、TNF-α和IL-6的mRNA的表達均較WT顯著升高(P0.01)。 (2)PLTP-/-BMDM炎癥因子的mRNA表達較WT部分有所升高： IL-10、TNF-α和IL-6升高(P0.05)， IFN-γ無明顯差異(P0.05)。 (3)PLTP-/-BMDM培養(yǎng)基中炎癥因子表達較WT均有所升高： IL-10和TNF-α升高198.5!(P0.05)， IL-6升高23.4!(P0.05)， IFN-γ無明顯差異(P0.05)。 2、 LPS刺激下WT和PLTP-/-BMDM及LPS刺激下PLTP konckdownRAW264.7p65和IκB-α結果； (1)BMDM核內p65含量， PLTP-/-較WT增加30.5!(P0.05)。 (2)BMDM胞漿內IκB-α含量， PLTP-/-較WT減少34!(P0.05)。 (3)RAW264.7核內p65含量， PLTP siRNA組較control siRNA組增加200!(P0.05)。 (4)RAW264.7胞漿內IκB-α含量，PLTP siRNA組較control siRNA組減少43!(P0.02)。 3、 TNF-α誘導的HUVEC p65和IκB-α結果 (1)HUVEC核內p65含量， PLTP siRNA組較Control siRNA組增加54!(P0.05)。 (2)HUVEC胞漿內IκB-α含量，PLTP siRNA組較Control siRNA組減少351.2!(P0.05)。 4、 LPS刺激下PLTP konckdown RAW264.7細胞120min和TNF-α刺激的PLTP konckdown HUVEC細胞120min時， pTAK1和TAK1蛋白表達結果； (1)在PLTP knockdown RAW264.7細胞中PLTP siRNA組較siRNA組在120min時增加了150!(P0.05)。 (2)在PLTP knockdown HUVEC細胞中，， PLTP siRNA組較siRNA組在120min時增加了3倍(P=0.05) 5、在加入格列苯脲后LPS誘導WT和PLTP-/-BMDM60min時pSTAT3蛋白結果； 在PLTP存在的情況下，pSTAT3的核內水平未發(fā)現(xiàn)明顯增加，說明在本實驗中未觀察到由巨噬細胞自身分泌的PLTP激活ABCA1-pSTAT3的現(xiàn)象。 6、 LPS誘導的WT和PLTP-/-BMDM、 LPS誘導的PLTP knockdownRAW264.7細胞和TNF-α誘導的PLTP konckdown RAW264.7細胞免疫熒光染色結果； (1)PLTP-/-BMDM較WT BMDM p65核轉位明顯增加。 (2)LPS誘導的RAW264.7細胞PLTP siRNA組較control siRNA組明顯增加。 (3)TNF-α誘導的HUVEC細胞PLTP siRNA組較control siRNA組明顯增加。 結論 (1)PLTP缺乏誘導的PDM和BMDM在LPS刺激下炎癥因子表達升高。 (2)PLTP缺乏增強了NFκB活性亞單位p65核轉位水平。 (3)RAW264.7和HUVEC中NFκB活性亞單位p65核轉位水平增強可能與TAK1磷酸化作用有關
【關鍵詞】：磷脂轉運蛋白 炎癥 核轉錄因子κB 基因敲除小鼠
【學位授予單位】：泰山醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R363
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• ABSTRACT8-12
• 符號說明12-13
• 前言13-17
• 材料與方法17-43
• 結果43-45
• 討論45-48
• 結論48-49
• 附圖49-56
• 參考文獻56-60
• 綜述60-72
• 參考文獻67-72
• 致謝72

【共引文獻】

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本文編號：407321