本文關(guān)鍵詞：小鼠支持細胞重編程為誘導(dǎo)多能干細胞的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：體細胞異位表達特異性轉(zhuǎn)錄因子可以重編程為誘導(dǎo)多能干細胞(induced pluripotent stem cells, iPS細胞)。iPS細胞不僅具有與胚胎干細胞(embryonic stem cells, ES細胞)相同的多能性和自我更新能力,還可以避免臨床治療過程中的免疫排斥和各種倫理道德問題。因此,iPS細胞技術(shù)不僅為科研基礎(chǔ)理論研究提供了新的技術(shù)手段,也為再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域帶來了廣闊的應(yīng)用前嘛號。目前,盡管已經(jīng)獲得多種體細胞來源的iPS細胞,但不同來源的iPS細胞質(zhì)量參差不齊,在基因表達圖圖譜,表觀遺傳修飾及分化能力等方面存在差異。因此,根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇合適的體細胞是獲得高質(zhì)量、具有發(fā)育全能性的優(yōu)質(zhì)iPS細胞的前提。 小鼠支持細胞(Sertoli cells)是睪丸的重要組成成分,具有免疫豁免和為生精過程提供適宜微環(huán)境的作用。離體培養(yǎng)時,支持細胞增殖速度較快,生長狀態(tài)良好,自身表達Klf4和c-Myc等基因。支持細胞分離純化后可得到高純度同質(zhì)性細胞群,排除了異質(zhì)性細胞群對重編程實驗的干擾。因此,支持細胞重編程為iPS細胞為后續(xù)誘導(dǎo)生精細胞提供源細胞。 一氧化氮(nitric oxide, NO)是細胞內(nèi)信號分子,參與干細胞生長增殖調(diào)控。NO對干細胞調(diào)控呈濃度依賴性,高濃度NO促進干細胞分化,低濃度NO維持干細胞多能性。探索NO對iPS細胞的影響對iPS細胞長期體外增殖分化有重要作用。 本實驗主要目的是將小鼠支持細胞重編程為iPS細胞并探索NO對iPS細胞的影響。分為以下方面：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的擴增與檢測；支持細胞的分離培養(yǎng)及純化；逆轉(zhuǎn)錄病毒液獲得及感染支持細胞；iPS克隆獲得及鑒定；低濃度NO對iPS細胞的影響。主要研究結(jié)果如下： 1.酶切和測序鑒定證實了擴增的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的準(zhǔn)確性。 2.獲得高純度小鼠支持細胞：通過兩步酶消化法從小鼠睪丸中分離支持細胞,并且通過密度梯度離心法及差速貼壁法純化小鼠支持細胞。原代培養(yǎng)的小鼠支持細胞具有良好的生長狀態(tài),SGP-1、SGP-2、Transferrin、ABP及AMHII等支持細胞特異性標(biāo)記物表達,Klf4和c-Myc表達水平較低,Nanog、Sox2及Oct4等多能基因不表達。 3.成功構(gòu)建小鼠支持細胞iPS細胞系：將四種重編程因子導(dǎo)入支持細胞,同時以GFP空載體檢測病毒感染情況。感染的支持細胞在3d左右表達GFP。同時細胞開始縮小聚集,失去原有支持細胞形態(tài),逐步形成突起樣克隆,18d左右感染的支持細胞不表達GFP熒光,形成具有典型干細胞特性的iPS細胞。iPS細胞可以體外長期增殖并保持正常核型。 4.iPS細胞系鑒定：iPS細胞AKP染色呈陽性,可表達多種ES細胞特異性基因,發(fā)Nanog、Oct4、Sox2、Rex1、Fbxl5、E-cad和Fgf4等,并且表達水平與ES細胞相近；Nanog和Oct4免疫染色呈陽性。在細胞周期調(diào)控模式上,iPS細胞與ES細胞相近。重編程的iPS細胞內(nèi)源多能基因激活,外源轉(zhuǎn)錄基因沉默。同時,iPS細胞具有分化為多種細胞的能力。體外培養(yǎng)時,可形成擬胚體,獲得的擬胚體可分化為三個胚層細胞,同時自發(fā)分化為跳動的克隆團；體內(nèi)培養(yǎng)時形成畸胎瘤,畸胎瘤經(jīng)HE染色后可以觀察到不同胚層的組織衍生物。 5.低濃度NO促進Nanog表達,維持多能基因Oct4和Sox2、抗凋亡基因Bcl2和Bc12lll及促凋亡基因Bac表達水平,下調(diào)促凋亡基因Bak1及Casp7基因表達水平。表明低濃度NO可以維持iPS細胞的多能性,并可以延緩在無LIF條件下iPS細胞的凋亡作用,維持其自我更新。
【關(guān)鍵詞】：支持細胞 重編程 轉(zhuǎn)錄因子 iPS細胞 一氧化氮
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 摘要8-10
• ABSTRACT10-12
• 縮略語中英文對照12-14
• 第一部分 文獻綜述14-24
• 第一章 體細胞重編程技術(shù)14-19
• 1. 體細胞核移植介導(dǎo)的細胞重編程14-15
• 2. 體細胞融合或共培養(yǎng)介導(dǎo)的體細胞重編程15
• 3. iPS細胞重編程技術(shù)15-17
• 4. 譜系重編程技術(shù)17-19
• 4.1 體內(nèi)重編程17-18
• 4.2 體外重編程18
• 4.3 譜系重編程特征18-19
• 參考文獻19-24
• 第二部分 試驗研究24-82
• 第一章 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的擴增與檢測24-34
• 1 材料與方法24-28
• 1.1 試驗材料24-25
• 1.2 試驗方法25-28
• 2 試驗結(jié)果與分析28-30
• 2.1 獲得單克隆最佳的接種體積28
• 2.2 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體濃度和純度鑒定28-29
• 2.3 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體測序鑒定29-30
• 3 討論30-31
• 參考文獻31-34
• 第二章 小鼠支持細胞的原代培養(yǎng)34-44
• 1 材料與方法34-39
• 1.1 試驗材料34-35
• 1.2 試驗方法35-39
• 2 試驗結(jié)果與分析39-40
• 2.1 支持細胞生物學(xué)特征39
• 2.2 支持細胞總RNA的完整性39
• 2.3 支持細胞PCR鑒定39-40
• 3 討論40-41
• 參考文獻41-44
• 第三章 小鼠支持細胞重編程為iPS細胞44-58
• 1 材料與方法44-49
• 1.1 試驗材料44-45
• 1.2 試驗方法45-49
• 2 試驗結(jié)果與分析49-55
• 2.1 原代培養(yǎng)MEF生物學(xué)特性49
• 2.2 逆轉(zhuǎn)錄病毒液的獲取49-50
• 2.3 逆轉(zhuǎn)錄病毒液滴度測定50-51
• 2.4 病毒液感染支持細胞后支持細胞重編程變化過程51-53
• 2.5 重編程過程中熒光蛋白表達與沉默53-54
• 2.6 iPS細胞獲得54-55
• 3. 討論55-56
• 參考文獻56-58
• 第四章 支持細胞來源的iPS細胞鑒定58-74
• 1 材料與方法58-64
• 1.1 試驗材料58-59
• 1.2 試驗方法59-64
• 2 試驗結(jié)果與分析64-69
• 2.1 iPS細胞AKP活性分析64-65
• 2.2 iPS細胞核型分析65
• 2.3 iPS細胞的周期分布模式65-67
• 2.4 iPS細胞多能基因表達模式67-68
• 2.5 iPS細胞體外分化68
• 2.6 iPS細胞體內(nèi)分化68-69
• 3. 討論69-71
• 參考文獻71-74
• 第五章 低濃度NO維持iPS細胞自我更新及多能性74-82
• 1 材料與方法74-76
• 1.1 試驗材料74-75
• 1.2 試驗方法75-76
• 2 試驗結(jié)果與分析76-79
• 2.1 多能基因Nanog表達水平分析76-78
• 2.2 多能基因Oct4表達水平分析78
• 2.3 多能基因Sox2表達水平分析78
• 2.4 抗凋亡基因Bcl2lll表達水平分析78
• 2.5 抗凋亡基因Bcl2表達水平分析78-79
• 2.6 促凋亡基因Bac表達水平分析79
• 2.7 促凋亡基因Bak1表達水平分析79
• 2.8 促凋亡基因Casp7表達水平分析79
• 3. 討論79-80
• 參考文獻80-82
• 全文結(jié)論82-84
• 創(chuàng)新點84-86
• 攻讀碩士期間發(fā)表的論文86-88
• 致謝88-89

【共引文獻】

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