本文關(guān)鍵詞：小鼠Bmall基因啟動(dòng)子的克隆及其熒光素酶報(bào)告基因載體的構(gòu)建，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：Bmal1基因又名MOP3或ARNTL(aryl-hydrocarbon receptor nuclear translocator like protein)，是重要的轉(zhuǎn)錄因子，于1997年被實(shí)驗(yàn)人員成功克隆。Bmal1基因包含Per-ARNT-Sim(PAS)和bHLH(basic Helix-Loop-Helix)結(jié)構(gòu)域，具有結(jié)合DNA并作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的功能。多種模式生物中均存在Bmal1同源基因。其中，大鼠Bmal1基因定位于1號(hào)染色體。利用報(bào)告基因系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)Bmal1轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游816bp到轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游99bp區(qū)段的轉(zhuǎn)錄活性最強(qiáng)。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，這一區(qū)段含有多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)于Bmal1轉(zhuǎn)錄至關(guān)重要的因子也結(jié)合于這一區(qū)域。最新研究表明DNA甲基化對(duì)于Bmal1的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮著核心調(diào)控作用，而受甲基化調(diào)控的CpG島也位于上述915bp區(qū)段。因此，該915bp的區(qū)段被廣泛用于Bmal1基因轉(zhuǎn)錄活性的研究。 Bmal1基因并非在所有的組織或細(xì)胞中均有表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)室的研究成果表明，，胚胎干細(xì)胞在Bmal1的表達(dá)層面即表現(xiàn)出異質(zhì)性。一部分細(xì)胞表現(xiàn)為Bmal1基因陽(yáng)性，另一部分細(xì)胞表現(xiàn)為Bmal1陰性。這種異質(zhì)性在胸腺和睪丸中也有所體現(xiàn)。目前尚無(wú)有效的方法能夠?qū)mal1陽(yáng)性和陰性的細(xì)胞區(qū)分篩選出來(lái)并進(jìn)行后續(xù)的研究。本課題為了解決這一技術(shù)瓶頸，利用基因工程的方法和技術(shù)構(gòu)建pLV-Bmal1-mCherry-EF1-copGFP-T2A-puro雙熒光載體。使我們可以很便利的研究Bmal1啟動(dòng)子在活體細(xì)胞和組織的生物學(xué)特性。 方法：我們首先明確Bmal1基因啟動(dòng)子區(qū)段。該啟動(dòng)子起始于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游816位堿基，延伸至轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游99位堿基，全長(zhǎng)915個(gè)堿基。這一區(qū)段含有多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，包括SP1, AP1, NF-Y。Rev-erb alpha, Rev-erb beta, RORa, RORb等對(duì)于Bmal1轉(zhuǎn)錄至關(guān)重要的因子也結(jié)合于這一區(qū)域。對(duì)于Bmal1的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮著重要調(diào)控作用的DNA甲基化影響的也是這一區(qū)段。該915bp的區(qū)段被廣泛用于Bmal1基因轉(zhuǎn)錄活性的研究。我們使用高保真酶，以小鼠肝臟基因組DNA為模板，擴(kuò)增Bmal1啟動(dòng)子序列。通過(guò)雙酶切將Bmal1基因啟動(dòng)子克隆到慢病毒載體pLV-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-puro中，從而得到中間克隆pLV-Bmal1-MCS-EF1-copGFP-T2A-puro。而后再次通過(guò)雙酶切，將紅色熒光蛋白（mCherry）克隆入pLV-Bmal1-MCS-EF1-copGFP-T2A-puro中，從而得到最終目的克隆pLV-Bmal1-mCherry-EF1-copGFP-T2A-puro。將該克隆與pLP1、pLP2、pLP3，共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，進(jìn)行病毒包裝。收獲病毒并經(jīng)超離心純化獲得濃縮病毒。獲得的病毒感染293T細(xì)胞檢測(cè)病毒滴度。 結(jié)果：以小鼠基因組DNA為模版，擴(kuò)增得到Bmal1基因啟動(dòng)子區(qū)段。經(jīng)過(guò)兩步克隆成功最終目的克隆pLV-Bmal1-mCherry-EF1-copGFP-T2A-puro，酶切和測(cè)序證實(shí)結(jié)構(gòu)正確。該克隆中存在兩套報(bào)告基因系統(tǒng)，其中紅色熒光蛋白的轉(zhuǎn)錄為Bmal1啟動(dòng)子所控制，綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)錄為組成型啟動(dòng)子EF1所控制。之所以這樣設(shè)計(jì)，是考慮到慢病毒感染細(xì)胞的效率可能達(dá)不到100%。由于EF1幾乎表達(dá)于所有種類的組織和細(xì)胞，當(dāng)病毒成功感染靶組織或細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞將表達(dá)綠色熒光蛋白，并發(fā)綠光。而未受病毒感染的細(xì)胞將不表達(dá)綠色熒光蛋白，從而不發(fā)光。只有發(fā)綠光的細(xì)胞才被認(rèn)為是病毒成功感染的細(xì)胞，也才會(huì)進(jìn)一步分析其中紅色熒光蛋白的表達(dá)情況，既Bmal1基因的表達(dá)情況。通過(guò)這種設(shè)計(jì)避免了區(qū)分和篩選時(shí)的假陰性。使用該克隆包裝的病毒感染HEK293細(xì)胞，經(jīng)病毒滴度檢測(cè)其滴度達(dá)到3*108TU/mL，可以用于后續(xù)感染實(shí)驗(yàn)。 結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了含受Bmal1啟動(dòng)子調(diào)控的紅色熒光蛋白慢病毒載體，并成功獲得了高滴度病毒。為區(qū)分Bmal1陽(yáng)性和陰性細(xì)胞，并分析其生物學(xué)特性的異同打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：Bmal1 啟動(dòng)子 載體構(gòu)建 慢病毒包裝
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R3416
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 前言9-10
• 材料與方法10-24
• 結(jié)果24-26
• 附圖26-34
• 附表34-35
• 討論35-38
• 結(jié)論38
• 參考文獻(xiàn)38-41
• 綜述 Bmal1 基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和生理功能41-50
• 參考文獻(xiàn)45-50
• 致謝50-51
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷51

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 金戈;生物節(jié)律的分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).遺傳學(xué)分冊(cè);1999年04期

  本文關(guān)鍵詞：小鼠Bmall基因啟動(dòng)子的克隆及其熒光素酶報(bào)告基因載體的構(gòu)建，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：406143