目 的 HBV具備改造作為肝靶向性基因治療載體的基本條件：天然嗜肝特異性；能夠在肝細(xì)胞內(nèi)持續(xù)復(fù)制、反復(fù)感染，病毒本身對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯細(xì)胞毒性；能夠攜帶外源基因并被包裝成病毒顆粒，介導(dǎo)目的基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)。但因基因結(jié)構(gòu)復(fù)雜，目前改造的HBV載體系統(tǒng)均存在載容量小、復(fù)制包裝效率低及安全性差等缺點(diǎn)。基于此，本課題借鑒體內(nèi)天然HBV變異株的生物學(xué)特性，優(yōu)化HBV載體改造策略，探索性構(gòu)建C基因截短型HBV載體，并對(duì)其表達(dá)、復(fù)制、包裝等分子生物學(xué)特性進(jìn)行探討。 方 法 1. 用外源GFP報(bào)告基因取代野生HBV質(zhì)粒pHBV3091 S基因編碼區(qū)，同時(shí)保留S基因前9個(gè)堿基與GFP融合，構(gòu)建攜帶外源報(bào)告基因的HBV載體pHBV-S-GFP。應(yīng)用脂質(zhì)體單獨(dú)轉(zhuǎn)染該HBV重組體，以GFP表達(dá)陽(yáng)性質(zhì)粒pCMV-GFP作對(duì)照，熒光顯微鏡下觀察GFP在肝細(xì)胞中表達(dá)。重組體pHBV-S-GFP與缺失包裝信號(hào)ε的輔助質(zhì)粒pHBV3142共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，提取細(xì)胞核中病毒DNA，根據(jù)HBV 基因組復(fù)制特點(diǎn)設(shè)計(jì)包含GFP及HBV DNA序列在內(nèi)的特異性引物，半巢式...

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

圖1-4中間質(zhì)粒產(chǎn)物pGEM-HBV(clone2)DNA測(cè)序結(jié)果

所有中間質(zhì)粒產(chǎn)物經(jīng)酶切、測(cè)序驗(yàn)證均與預(yù)期結(jié)果吻合，最終證實(shí)攜帶外源GFP報(bào)告基因的重組HBV載體pHBV-S-GFP構(gòu)建成功。見(jiàn)圖1-3~圖1-6。圖1-4中間質(zhì)粒產(chǎn)物pGEM-HBV(clone2)DNA測(cè)序結(jié)果2000bp1000bp100bp200bp....

圖1-9半巢式PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中攜帶GFP基因的HBVcccDNA

約870bp的HBVDNA片段（從P基因翻譯起始密碼子到EcoRI酶切位點(diǎn)的HBV基因片段，見(jiàn)圖1-2）及長(zhǎng)約720bp的GFP基因片段，見(jiàn)圖1-10。野圖1-9半巢式PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中攜帶GFP基因的HBVcccDNA。Lane2、l....

圖1-10PCR檢測(cè)上清液中子代病毒DNALane1:200bpDNAmarker；Lane2:pHBV-S-GFP+pHBV3142

第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文pHBV3091單獨(dú)轉(zhuǎn)染后，在上清液提取物中僅擴(kuò)增產(chǎn)物，而沒(méi)有擴(kuò)增出相應(yīng)的GFP產(chǎn)物（資料未顯示lot檢測(cè)上清液中子代病毒顆粒的包裝GFP載體單獨(dú)轉(zhuǎn)染后，上清液中子代病毒顆粒提信號(hào)，相反與缺失包裝信號(hào)ε的輔助質(zhì)粒pHBV3可見(jiàn)到各種構(gòu)型的H....

圖2-4Southernblot檢測(cè)胞漿中HBVDNA復(fù)制中間體

第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文截短型HBV突變體在輔助質(zhì)粒pHBV3142輔到恢復(fù)nblot分析C基因截短導(dǎo)致HBV突變體復(fù)制包裝能力喪HBVΔC188和pHBVΔC141分別單獨(dú)轉(zhuǎn)染HepG2液中HBV病毒顆粒DNA進(jìn)行S....

本文編號(hào)：4044719