本文關(guān)鍵詞：與小型非編碼RNA相關(guān)的血吸蟲基因操作技術(shù)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：血吸蟲屬于扁形動(dòng)物門裂體吸蟲綱,感染后所引起的血吸蟲病是僅次于瘧疾的世界第二大寄生蟲疾病。血吸蟲病的急性癥狀包括尾蚴皮炎和一系列超敏反應(yīng),而慢性血吸蟲感染往往造成泌尿系統(tǒng)或肝腸部位的病理損傷。目前,針對(duì)三種主要血吸蟲病病原(曼氏血吸蟲、日本血吸蟲和埃及血吸蟲)的基因組、轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究已經(jīng)取得了一定進(jìn)展,下一步的工作將是針對(duì)那些組學(xué)揭示的蛋白編碼基因或具有調(diào)控功能的小RNA基因進(jìn)行功能研究。RNA干擾(RNAi)是一類發(fā)生于真核細(xì)胞或病毒中的由雙鏈RNA誘導(dǎo)產(chǎn)生的基因沉默現(xiàn)象,siRNA與miRNA代表了兩種主要的RNAi誘發(fā)因子。siRNA通常作為一種反向遺傳學(xué)工具被用于蛋白編碼基因的功能研究,miRNA則是一種內(nèi)源的基因表達(dá)調(diào)控分子,在不同生物體中具有重要的生理功能。本研究將圍繞siRNA和miRNA這兩種小型非編碼RNA分子,探索相關(guān)的血吸蟲基因操作技術(shù)。首先,我們將外源siRNA引發(fā)的RNAi作為一種技術(shù)工具來進(jìn)行日本血吸蟲醛糖還原酶(SjAR)基因的功能研究。針對(duì)SjAR基因的前期基礎(chǔ)性研究推測(cè)其可能參與了蟲體的抗宿主氧化機(jī)制,同時(shí)證實(shí)了基于SjAR蛋白三維結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)出的候選藥物具有良好的殺蟲效果。本研究首先設(shè)計(jì)并合成了兩條針對(duì)SjAR轉(zhuǎn)錄本不同位置的siRNA,嘗試使用電轉(zhuǎn)和浸泡兩種手段向感染后14天的日本血吸蟲童蟲中轉(zhuǎn)化siRNA分子。在完成了蟲體RNA抽提、反轉(zhuǎn)錄等步驟后,用熒光定量PCR檢測(cè)SjAR基因轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,浸泡法實(shí)施的RNAi成功地降低了SjAR在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá),siRNA處理組的SjAR轉(zhuǎn)錄本水平顯著地低于對(duì)照組。然而,電轉(zhuǎn)法實(shí)施的RNAi并未取得理想的效果,siRNA處理組與對(duì)照組的SjAR轉(zhuǎn)錄本水平并沒有顯著性差異。此后,我們使用Western雜交的方法檢測(cè)了浸泡法處理對(duì)于SjAR蛋白表達(dá)水平的影響,結(jié)果顯示siRNA處理組蟲體的SjAR蛋白含量確實(shí)低于對(duì)照組。對(duì)SjAR基因表達(dá)水平降低的蟲體進(jìn)行顯微觀察并未發(fā)現(xiàn)明顯的表型變化。此外,我們對(duì)血吸蟲內(nèi)源miRNA調(diào)控功能開展了研究。為了驗(yàn)證血吸蟲miRNA與靶信使RNA(mRNA)的互作關(guān)系,我們開發(fā)了針對(duì)血吸蟲的miRNA海綿技術(shù)平臺(tái)。熒光蛋白和熒光素酶作為兩種報(bào)告基因被用于了miRNA海綿轉(zhuǎn)錄本表達(dá)效果的驗(yàn)證；而電轉(zhuǎn)被當(dāng)做轉(zhuǎn)化方法以實(shí)現(xiàn)外源基因在血吸蟲細(xì)胞中的表達(dá)。針對(duì)GFP、Cherry兩種熒光蛋白質(zhì)粒DNA的電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化操作并不能誘發(fā)明顯的蟲體發(fā)光現(xiàn)象,且蟲體本身就具有的自發(fā)熒光現(xiàn)象影響了熒光蛋白做為報(bào)告基因在血吸蟲領(lǐng)域的應(yīng)用。然而,隨后對(duì)于熒光素酶mRNA或質(zhì)粒DNA的電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化操作獲得了良好的結(jié)果,蟲體表達(dá)的熒光素酶能夠高效地催化底物發(fā)光。不僅如此,當(dāng)在熒光素酶編碼序列的下游引入串聯(lián)重復(fù)的血吸蟲miR-71結(jié)合單位后,蟲體表達(dá)的熒光素酶活力顯著下降。以上結(jié)果證明了應(yīng)用以熒光素酶為報(bào)告基因的miRNA海綿進(jìn)行血吸蟲miRNA調(diào)控功能研究的可行性。隨后,我們對(duì)日本血吸蟲miR-71的作用靶基因進(jìn)行了預(yù)測(cè),共得出了5個(gè)可能被miR-71調(diào)控的日本血吸蟲基因。為了將來能夠在蛋白水平上檢測(cè)轉(zhuǎn)入miR-71海綿對(duì)于靶基因表達(dá)的影響,針對(duì)這5個(gè)靶基因蛋白產(chǎn)物的特異性抗體是必不可少的。為此我們嘗試使用大腸桿菌系統(tǒng)對(duì)5個(gè)靶基因進(jìn)行重組表達(dá),最終在免疫過后成功地獲得了針對(duì)其中一個(gè)靶基因重組蛋白的高滴度多克隆抗體。在不久的將來,Western雜交和miRNA海綿一起能夠幫助我們驗(yàn)證血吸蟲miR-71與靶基因間的互作關(guān)系。
【關(guān)鍵詞】：血吸蟲 RNA干擾 miRNA海綿 醛糖還原酶 miR-71
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R383.24;Q78
【目錄】：

• 摘要8-10
• Abstract10-12
• 第1章 序言12-20
• 一. 血吸蟲病：僅次于瘧疾的世界第二大寄生蟲疾病12-16
• 1. 血吸蟲病病原的形態(tài)特征和生活史12-13
• 2. 人類血吸蟲病的主要病原種類及分布13-14
• 3. 血吸蟲病的癥狀14-15
• 4. 三種主要人類血吸蟲病病原的基因組、轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究進(jìn)展15-16
• 二. RNA干擾(RNAi)：雙鏈RNA(dsRNA)引發(fā)的基因沉默現(xiàn)象16-17
• 三. miRNA：起源于莖環(huán)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄本的內(nèi)源性非編碼RNA17-20
• 第2章 日本血吸蟲醛糖還原酶(SjAR)基因的RNA干擾20-43
• 一. 研究背景與技術(shù)路線20-24
• 1. 研究背景20-22
• 1.1 RNAi技術(shù)在血吸蟲功能基因組學(xué)研究中的應(yīng)用20-22
• 1.2 日本血吸蟲醛糖還原酶(SjAR)的研究進(jìn)展22
• 2. 技術(shù)路線22-24
• 二. 實(shí)驗(yàn)材料與儀器24-27
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料24-25
• 1.1 培養(yǎng)基與電轉(zhuǎn)緩沖液24
• 1.2 引物24
• 1.3 siRNAs24-25
• 1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物25
• 1.5 血清25
• 1.6 其他試劑與耗材25
• 2. 主要實(shí)驗(yàn)儀器25-27
• 三. 實(shí)驗(yàn)方法27-34
• 1. 電轉(zhuǎn)法進(jìn)行SjAR基因的RNAi27-31
• 1.1 使用日本血吸蟲尾蚴感染昆明鼠27
• 1.2 灌注小鼠肝門靜脈進(jìn)行血吸蟲蟲體采集27-28
• 1.3 使用電轉(zhuǎn)法對(duì)感染后14天童蟲進(jìn)行RNAi操作28
• 1.4 血吸蟲全RNA的小量提取28-29
• 1.5 血吸蟲cDNA的制備29-30
• 1.6 cDNA中的基因組DNA(gDNA)污染情況檢測(cè)30
• 1.7 cDNA完整性檢測(cè)30
• 1.8 實(shí)時(shí)定量檢測(cè)RNAi處理組與對(duì)照組SjAR基因轉(zhuǎn)錄水平差異30-31
• 2. 浸泡法進(jìn)行SjAR基因的RNAi31-34
• 2.1 使用日本血吸蟲尾蚴感染昆明鼠31
• 2.2 灌注小鼠肝門靜脈進(jìn)行血吸蟲蟲體采集31
• 2.3 使用浸泡法對(duì)感染后14天童蟲進(jìn)行RNAi操作31-32
• 2.4 血吸蟲全RNA的小量提取32
• 2.5 從Trizol法提取血吸蟲RNA的剩余樣品中提取血吸蟲蛋白32
• 2.6 血吸蟲cDNA的制備32-33
• 2.7 實(shí)時(shí)定量檢測(cè)RNAi處理組與對(duì)照組SjAR基因轉(zhuǎn)錄水平差異33
• 2.8 Western雜交檢測(cè)RNAi處理組與對(duì)照組SjAR基因在蛋白水平上的表達(dá)差異33-34
• 四. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果34-41
• 1. 電轉(zhuǎn)法進(jìn)行SjAR基因的RNAi34-37
• 1.1 電轉(zhuǎn)法RNAi處理的分組情況和蟲體RNA提取結(jié)果34
• 1.2 cDNA的完整性和gDNA污染情況檢測(cè)34-35
• 1.3 熒光定量PCR檢測(cè)電轉(zhuǎn)法RNAi處理在SjAR基因轉(zhuǎn)錄水平上的效果35-37
• 1.4 小結(jié)37
• 2. 浸泡法進(jìn)行SjAR基因的RNAi37-41
• 2.1 浸泡法RNAi實(shí)驗(yàn)的分組情況和蟲體RNA提取結(jié)果37-38
• 2.2 熒光定量PCR檢測(cè)浸泡法RNAi處理在SjAR基因轉(zhuǎn)錄水平上的效果38-39
• 2.3 Western雜交檢測(cè)浸泡法RNAi處理在SjAR蛋白水平上的效果39-40
• 2.4 小結(jié)40-41
• 五. 分析與展望41-43
• 第3章 血吸蟲miRNAs海綿技術(shù)的開發(fā)43-83
• 一. 研究背景與技術(shù)路線43-50
• 1. 研究背景43-48
• 1.1 血吸蟲內(nèi)源小型非編碼RNA(sncRNA)的組學(xué)研究進(jìn)展43
• 1.2 miRNA海綿技術(shù)：競(jìng)爭(zhēng)性地抑制miRNA調(diào)控功能43-45
• 1.3 血吸蟲外源基因轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染技術(shù)的研究進(jìn)展45-48
• 2. 技術(shù)路線48-50
• 二. 實(shí)驗(yàn)材料與儀器50-53
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料50-52
• 1.1 培養(yǎng)基、緩沖液與洗液50
• 1.2 引物50-51
• 1.3 質(zhì)粒與菌株51
• 1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物51
• 1.5 其他試劑與耗材51-52
• 2. 主要實(shí)驗(yàn)儀器52-53
• 三. 實(shí)驗(yàn)方法53-67
• 1. 日本血吸蟲高效熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建53-56
• 1.1 原始質(zhì)粒的大量制備及保種53
• 1.2 pFB-CMV-Cherry質(zhì)粒的構(gòu)建、保種與大量制備53-55
• 1.3 日本血吸蟲高效熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒pFB-SjAct-Cherry(GFP)的構(gòu)建55-56
• 2. 熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化與蟲體發(fā)光情況觀察56-58
• 2.1 使用電轉(zhuǎn)法向日本血吸蟲童蟲、成蟲中轉(zhuǎn)化熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒56-57
• 2.2 熒光顯微鏡下觀察蟲體發(fā)光情況57-58
• 3. 以螢火蟲熒光素酶為報(bào)告基因的血吸蟲miR-71海綿表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建58-61
• 3.1 靶向血吸蟲miR-71的miRNA海綿序列設(shè)計(jì)與化學(xué)合成58
• 3.2 pGL3-Basic-Sponge質(zhì)粒的構(gòu)建58-60
• 3.3 pJC1-Sponge質(zhì)粒的構(gòu)建與大量制備60-61
• 4. 血吸蟲miR-71海綿表達(dá)構(gòu)件的電轉(zhuǎn)化與效果評(píng)定61-67
• 4.1 曼氏血吸蟲尾蚴的釋放與收集61-62
• 4.2 使用雙頭注射器進(jìn)行曼氏血吸蟲尾蚴去尾轉(zhuǎn)化62-64
• 4.3 miR-71海綿的體外轉(zhuǎn)錄64
• 4.4 使用電轉(zhuǎn)法向去尾轉(zhuǎn)化的童蟲體內(nèi)導(dǎo)入海綿表達(dá)構(gòu)件(質(zhì)粒DNA或體外轉(zhuǎn)錄的mRNA)64-65
• 4.5 蟲體裂解液熒光素酶酶活的測(cè)定65-66
• 4.6 感染后14天日本血吸蟲童蟲電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化效率的檢測(cè)66-67
• 四. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果67-81
• 1. 日本血吸蟲高效熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建67-70
• 1.1 原始質(zhì)粒的大量制備及保種67
• 1.2 pFB-CMV-Cherry質(zhì)粒的構(gòu)建、保種與大量制備67-68
• 1.3 SjAct基因啟動(dòng)子序列轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析68-69
• 1.4 日本血吸蟲高效熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒pFB-SjAct-Cherry(GFP)的構(gòu)建69-70
• 1.5 小結(jié)70
• 2. 熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化與蟲體發(fā)光情況觀察70-72
• 2.1 熒光顯微鏡觀察結(jié)果70-72
• 2.2 小結(jié)72
• 3. 以螢火蟲熒光素酶為報(bào)告基因的血吸蟲miR-71海綿表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建72-76
• 3.1 日本、曼氏血吸蟲miR-71序列的查找以及miR-71海綿序列的設(shè)計(jì)與化學(xué)合成72-73
• 3.2 pGL3-Basic-Sponge質(zhì)粒的構(gòu)建73-74
• 3.3 pJC1-Sponge質(zhì)粒的構(gòu)建74-75
• 3.4 小結(jié)75-76
• 4. 血吸蟲miR-71海綿表達(dá)構(gòu)件的電轉(zhuǎn)化與效果評(píng)定76-81
• 4.1 曼氏血吸蟲尾蚴的釋放、收集與去尾轉(zhuǎn)化76
• 4.2 mLuc與mLuc+Sponge兩種mRNA的體外轉(zhuǎn)錄76-77
• 4.3 海綿mRNA的電轉(zhuǎn)化以及蟲體勻漿熒光素酶活力測(cè)定77-78
• 4.4 海綿質(zhì)粒DNA的電轉(zhuǎn)化以及蟲體勻漿熒光素酶活力的測(cè)定78-79
• 4.5 感染后14天的日本血吸蟲電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化效率的檢測(cè)79-80
• 4.6 小結(jié)80-81
• 五. 分析與展望81-83
• 第4章 日本血吸蟲miR-71的靶基因預(yù)測(cè)與批量表達(dá)83-101
• 一. 研究背景與技術(shù)路線83-85
• 1. 研究背景83-84
• 1.1 血吸蟲及其它生物體中miR-71家族的研究進(jìn)展83-84
• 2. 技術(shù)路線84-85
• 二. 實(shí)驗(yàn)材料與儀器85-88
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料85-86
• 1.1 培養(yǎng)基85
• 1.2 引物85
• 1.3 質(zhì)粒和菌株85
• 1.4 血清85-86
• 1.5 純化介質(zhì)和預(yù)裝柱86
• 1.6 蛋白凝膠染色液與脫色液86
• 1.7 包涵體蛋白過柱純化過程的相關(guān)試劑86
• 1.8 其它試劑與耗材86
• 2. 主要實(shí)驗(yàn)儀器86-88
• 三. 實(shí)驗(yàn)方法88-94
• 1. 日本血吸蟲miR-71作用靶基因的預(yù)測(cè)88
• 2. 日本血吸蟲miR-71作用靶基因的批量表達(dá)與純化88-92
• 2.1 五個(gè)基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建88-90
• 2.2 對(duì)表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功的靶基因進(jìn)行小量誘導(dǎo)表達(dá)90
• 2.3 可誘導(dǎo)的蛋白的大量制備90-91
• 2.4 包涵體蛋白的變性和過柱純化91-92
• 3. 重組蛋白兔多克隆抗體的制備及滴度評(píng)價(jià)92-94
• 3.1 兔多克隆抗體的制備92
• 3.2 間接ELISA法評(píng)價(jià)多克隆抗體滴度92-94
• 四. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果94-99
• 1. 日本血吸蟲miR-71作用靶基因的預(yù)測(cè)94-95
• 2. 日本血吸蟲miR-71作用靶基因的批量表達(dá)與純化95-97
• 2.1 五個(gè)基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建95
• 2.2 對(duì)表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功的靶基因進(jìn)行小量誘導(dǎo)表達(dá)95-96
• 2.3 可誘導(dǎo)的蛋白的大量制備96-97
• 2.4 包涵體蛋白的變性和過柱純化97
• 2.5 小結(jié)97
• 3. 重組蛋白兔多克隆抗體的制備及滴度評(píng)價(jià)97-99
• 五. 分析與展望99-101
• 本研究的意義和創(chuàng)新點(diǎn)101-102
• 參考文獻(xiàn)102-109
• 致謝109-110

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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本文編號(hào)：403429