本文關鍵詞：與小型非編碼RNA相關的血吸蟲基因操作技術研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：血吸蟲屬于扁形動物門裂體吸蟲綱,感染后所引起的血吸蟲病是僅次于瘧疾的世界第二大寄生蟲疾病。血吸蟲病的急性癥狀包括尾蚴皮炎和一系列超敏反應,而慢性血吸蟲感染往往造成泌尿系統(tǒng)或肝腸部位的病理損傷。目前,針對三種主要血吸蟲病病原(曼氏血吸蟲、日本血吸蟲和埃及血吸蟲)的基因組、轉錄組學研究已經(jīng)取得了一定進展,下一步的工作將是針對那些組學揭示的蛋白編碼基因或具有調(diào)控功能的小RNA基因進行功能研究。RNA干擾(RNAi)是一類發(fā)生于真核細胞或病毒中的由雙鏈RNA誘導產(chǎn)生的基因沉默現(xiàn)象,siRNA與miRNA代表了兩種主要的RNAi誘發(fā)因子。siRNA通常作為一種反向遺傳學工具被用于蛋白編碼基因的功能研究,miRNA則是一種內(nèi)源的基因表達調(diào)控分子,在不同生物體中具有重要的生理功能。本研究將圍繞siRNA和miRNA這兩種小型非編碼RNA分子,探索相關的血吸蟲基因操作技術。首先,我們將外源siRNA引發(fā)的RNAi作為一種技術工具來進行日本血吸蟲醛糖還原酶(SjAR)基因的功能研究。針對SjAR基因的前期基礎性研究推測其可能參與了蟲體的抗宿主氧化機制,同時證實了基于SjAR蛋白三維結構設計出的候選藥物具有良好的殺蟲效果。本研究首先設計并合成了兩條針對SjAR轉錄本不同位置的siRNA,嘗試使用電轉和浸泡兩種手段向感染后14天的日本血吸蟲童蟲中轉化siRNA分子。在完成了蟲體RNA抽提、反轉錄等步驟后,用熒光定量PCR檢測SjAR基因轉錄本的表達水平。結果顯示,浸泡法實施的RNAi成功地降低了SjAR在轉錄水平上的表達,siRNA處理組的SjAR轉錄本水平顯著地低于對照組。然而,電轉法實施的RNAi并未取得理想的效果,siRNA處理組與對照組的SjAR轉錄本水平并沒有顯著性差異。此后,我們使用Western雜交的方法檢測了浸泡法處理對于SjAR蛋白表達水平的影響,結果顯示siRNA處理組蟲體的SjAR蛋白含量確實低于對照組。對SjAR基因表達水平降低的蟲體進行顯微觀察并未發(fā)現(xiàn)明顯的表型變化。此外,我們對血吸蟲內(nèi)源miRNA調(diào)控功能開展了研究。為了驗證血吸蟲miRNA與靶信使RNA(mRNA)的互作關系,我們開發(fā)了針對血吸蟲的miRNA海綿技術平臺。熒光蛋白和熒光素酶作為兩種報告基因被用于了miRNA海綿轉錄本表達效果的驗證；而電轉被當做轉化方法以實現(xiàn)外源基因在血吸蟲細胞中的表達。針對GFP、Cherry兩種熒光蛋白質(zhì)粒DNA的電轉轉化操作并不能誘發(fā)明顯的蟲體發(fā)光現(xiàn)象,且蟲體本身就具有的自發(fā)熒光現(xiàn)象影響了熒光蛋白做為報告基因在血吸蟲領域的應用。然而,隨后對于熒光素酶mRNA或質(zhì)粒DNA的電轉轉化操作獲得了良好的結果,蟲體表達的熒光素酶能夠高效地催化底物發(fā)光。不僅如此,當在熒光素酶編碼序列的下游引入串聯(lián)重復的血吸蟲miR-71結合單位后,蟲體表達的熒光素酶活力顯著下降。以上結果證明了應用以熒光素酶為報告基因的miRNA海綿進行血吸蟲miRNA調(diào)控功能研究的可行性。隨后,我們對日本血吸蟲miR-71的作用靶基因進行了預測,共得出了5個可能被miR-71調(diào)控的日本血吸蟲基因。為了將來能夠在蛋白水平上檢測轉入miR-71海綿對于靶基因表達的影響,針對這5個靶基因蛋白產(chǎn)物的特異性抗體是必不可少的。為此我們嘗試使用大腸桿菌系統(tǒng)對5個靶基因進行重組表達,最終在免疫過后成功地獲得了針對其中一個靶基因重組蛋白的高滴度多克隆抗體。在不久的將來,Western雜交和miRNA海綿一起能夠幫助我們驗證血吸蟲miR-71與靶基因間的互作關系。
【關鍵詞】：血吸蟲 RNA干擾 miRNA海綿 醛糖還原酶 miR-71
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R383.24;Q78
【目錄】：

• 摘要8-10
• Abstract10-12
• 第1章 序言12-20
• 一. 血吸蟲�。簝H次于瘧疾的世界第二大寄生蟲疾病12-16
• 1. 血吸蟲病病原的形態(tài)特征和生活史12-13
• 2. 人類血吸蟲病的主要病原種類及分布13-14
• 3. 血吸蟲病的癥狀14-15
• 4. 三種主要人類血吸蟲病病原的基因組、轉錄組學研究進展15-16
• 二. RNA干擾(RNAi)：雙鏈RNA(dsRNA)引發(fā)的基因沉默現(xiàn)象16-17
• 三. miRNA：起源于莖環(huán)結構轉錄本的內(nèi)源性非編碼RNA17-20
• 第2章 日本血吸蟲醛糖還原酶(SjAR)基因的RNA干擾20-43
• 一. 研究背景與技術路線20-24
• 1. 研究背景20-22
• 1.1 RNAi技術在血吸蟲功能基因組學研究中的應用20-22
• 1.2 日本血吸蟲醛糖還原酶(SjAR)的研究進展22
• 2. 技術路線22-24
• 二. 實驗材料與儀器24-27
• 1. 實驗材料24-25
• 1.1 培養(yǎng)基與電轉緩沖液24
• 1.2 引物24
• 1.3 siRNAs24-25
• 1.4 實驗動物25
• 1.5 血清25
• 1.6 其他試劑與耗材25
• 2. 主要實驗儀器25-27
• 三. 實驗方法27-34
• 1. 電轉法進行SjAR基因的RNAi27-31
• 1.1 使用日本血吸蟲尾蚴感染昆明鼠27
• 1.2 灌注小鼠肝門靜脈進行血吸蟲蟲體采集27-28
• 1.3 使用電轉法對感染后14天童蟲進行RNAi操作28
• 1.4 血吸蟲全RNA的小量提取28-29
• 1.5 血吸蟲cDNA的制備29-30
• 1.6 cDNA中的基因組DNA(gDNA)污染情況檢測30
• 1.7 cDNA完整性檢測30
• 1.8 實時定量檢測RNAi處理組與對照組SjAR基因轉錄水平差異30-31
• 2. 浸泡法進行SjAR基因的RNAi31-34
• 2.1 使用日本血吸蟲尾蚴感染昆明鼠31
• 2.2 灌注小鼠肝門靜脈進行血吸蟲蟲體采集31
• 2.3 使用浸泡法對感染后14天童蟲進行RNAi操作31-32
• 2.4 血吸蟲全RNA的小量提取32
• 2.5 從Trizol法提取血吸蟲RNA的剩余樣品中提取血吸蟲蛋白32
• 2.6 血吸蟲cDNA的制備32-33
• 2.7 實時定量檢測RNAi處理組與對照組SjAR基因轉錄水平差異33
• 2.8 Western雜交檢測RNAi處理組與對照組SjAR基因在蛋白水平上的表達差異33-34
• 四. 實驗結果34-41
• 1. 電轉法進行SjAR基因的RNAi34-37
• 1.1 電轉法RNAi處理的分組情況和蟲體RNA提取結果34
• 1.2 cDNA的完整性和gDNA污染情況檢測34-35
• 1.3 熒光定量PCR檢測電轉法RNAi處理在SjAR基因轉錄水平上的效果35-37
• 1.4 小結37
• 2. 浸泡法進行SjAR基因的RNAi37-41
• 2.1 浸泡法RNAi實驗的分組情況和蟲體RNA提取結果37-38
• 2.2 熒光定量PCR檢測浸泡法RNAi處理在SjAR基因轉錄水平上的效果38-39
• 2.3 Western雜交檢測浸泡法RNAi處理在SjAR蛋白水平上的效果39-40
• 2.4 小結40-41
• 五. 分析與展望41-43
• 第3章 血吸蟲miRNAs海綿技術的開發(fā)43-83
• 一. 研究背景與技術路線43-50
• 1. 研究背景43-48
• 1.1 血吸蟲內(nèi)源小型非編碼RNA(sncRNA)的組學研究進展43
• 1.2 miRNA海綿技術：競爭性地抑制miRNA調(diào)控功能43-45
• 1.3 血吸蟲外源基因轉化、轉染技術的研究進展45-48
• 2. 技術路線48-50
• 二. 實驗材料與儀器50-53
• 1. 實驗材料50-52
• 1.1 培養(yǎng)基、緩沖液與洗液50
• 1.2 引物50-51
• 1.3 質(zhì)粒與菌株51
• 1.4 實驗動物51
• 1.5 其他試劑與耗材51-52
• 2. 主要實驗儀器52-53
• 三. 實驗方法53-67
• 1. 日本血吸蟲高效熒光蛋白表達質(zhì)粒的構建53-56
• 1.1 原始質(zhì)粒的大量制備及保種53
• 1.2 pFB-CMV-Cherry質(zhì)粒的構建、保種與大量制備53-55
• 1.3 日本血吸蟲高效熒光蛋白表達質(zhì)粒pFB-SjAct-Cherry(GFP)的構建55-56
• 2. 熒光蛋白表達質(zhì)粒的轉化與蟲體發(fā)光情況觀察56-58
• 2.1 使用電轉法向日本血吸蟲童蟲、成蟲中轉化熒光蛋白表達質(zhì)粒56-57
• 2.2 熒光顯微鏡下觀察蟲體發(fā)光情況57-58
• 3. 以螢火蟲熒光素酶為報告基因的血吸蟲miR-71海綿表達質(zhì)粒的構建58-61
• 3.1 靶向血吸蟲miR-71的miRNA海綿序列設計與化學合成58
• 3.2 pGL3-Basic-Sponge質(zhì)粒的構建58-60
• 3.3 pJC1-Sponge質(zhì)粒的構建與大量制備60-61
• 4. 血吸蟲miR-71海綿表達構件的電轉化與效果評定61-67
• 4.1 曼氏血吸蟲尾蚴的釋放與收集61-62
• 4.2 使用雙頭注射器進行曼氏血吸蟲尾蚴去尾轉化62-64
• 4.3 miR-71海綿的體外轉錄64
• 4.4 使用電轉法向去尾轉化的童蟲體內(nèi)導入海綿表達構件(質(zhì)粒DNA或體外轉錄的mRNA)64-65
• 4.5 蟲體裂解液熒光素酶酶活的測定65-66
• 4.6 感染后14天日本血吸蟲童蟲電轉轉化效率的檢測66-67
• 四. 實驗結果67-81
• 1. 日本血吸蟲高效熒光蛋白表達質(zhì)粒的構建67-70
• 1.1 原始質(zhì)粒的大量制備及保種67
• 1.2 pFB-CMV-Cherry質(zhì)粒的構建、保種與大量制備67-68
• 1.3 SjAct基因啟動子序列轉錄因子結合位點分析68-69
• 1.4 日本血吸蟲高效熒光蛋白表達質(zhì)粒pFB-SjAct-Cherry(GFP)的構建69-70
• 1.5 小結70
• 2. 熒光蛋白表達質(zhì)粒的轉化與蟲體發(fā)光情況觀察70-72
• 2.1 熒光顯微鏡觀察結果70-72
• 2.2 小結72
• 3. 以螢火蟲熒光素酶為報告基因的血吸蟲miR-71海綿表達質(zhì)粒的構建72-76
• 3.1 日本、曼氏血吸蟲miR-71序列的查找以及miR-71海綿序列的設計與化學合成72-73
• 3.2 pGL3-Basic-Sponge質(zhì)粒的構建73-74
• 3.3 pJC1-Sponge質(zhì)粒的構建74-75
• 3.4 小結75-76
• 4. 血吸蟲miR-71海綿表達構件的電轉化與效果評定76-81
• 4.1 曼氏血吸蟲尾蚴的釋放、收集與去尾轉化76
• 4.2 mLuc與mLuc+Sponge兩種mRNA的體外轉錄76-77
• 4.3 海綿mRNA的電轉化以及蟲體勻漿熒光素酶活力測定77-78
• 4.4 海綿質(zhì)粒DNA的電轉化以及蟲體勻漿熒光素酶活力的測定78-79
• 4.5 感染后14天的日本血吸蟲電轉轉化效率的檢測79-80
• 4.6 小結80-81
• 五. 分析與展望81-83
• 第4章 日本血吸蟲miR-71的靶基因預測與批量表達83-101
• 一. 研究背景與技術路線83-85
• 1. 研究背景83-84
• 1.1 血吸蟲及其它生物體中miR-71家族的研究進展83-84
• 2. 技術路線84-85
• 二. 實驗材料與儀器85-88
• 1. 實驗材料85-86
• 1.1 培養(yǎng)基85
• 1.2 引物85
• 1.3 質(zhì)粒和菌株85
• 1.4 血清85-86
• 1.5 純化介質(zhì)和預裝柱86
• 1.6 蛋白凝膠染色液與脫色液86
• 1.7 包涵體蛋白過柱純化過程的相關試劑86
• 1.8 其它試劑與耗材86
• 2. 主要實驗儀器86-88
• 三. 實驗方法88-94
• 1. 日本血吸蟲miR-71作用靶基因的預測88
• 2. 日本血吸蟲miR-71作用靶基因的批量表達與純化88-92
• 2.1 五個基因表達質(zhì)粒的構建88-90
• 2.2 對表達質(zhì)粒構建成功的靶基因進行小量誘導表達90
• 2.3 可誘導的蛋白的大量制備90-91
• 2.4 包涵體蛋白的變性和過柱純化91-92
• 3. 重組蛋白兔多克隆抗體的制備及滴度評價92-94
• 3.1 兔多克隆抗體的制備92
• 3.2 間接ELISA法評價多克隆抗體滴度92-94
• 四. 實驗結果94-99
• 1. 日本血吸蟲miR-71作用靶基因的預測94-95
• 2. 日本血吸蟲miR-71作用靶基因的批量表達與純化95-97
• 2.1 五個基因表達質(zhì)粒的構建95
• 2.2 對表達質(zhì)粒構建成功的靶基因進行小量誘導表達95-96
• 2.3 可誘導的蛋白的大量制備96-97
• 2.4 包涵體蛋白的變性和過柱純化97
• 2.5 小結97
• 3. 重組蛋白兔多克隆抗體的制備及滴度評價97-99
• 五. 分析與展望99-101
• 本研究的意義和創(chuàng)新點101-102
• 參考文獻102-109
• 致謝109-110

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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本文編號：403429