麻疹病毒囊膜蛋白由血凝素蛋白(MV-H)和融合蛋白(MV-F)組成,它與易感細胞表面上的病毒受體蛋白結合介導了麻疹病毒的侵染。盡管麻疹病毒囊膜蛋白能誘使麻疹感染患者出現(xiàn)免疫抑制這一現(xiàn)象已經在科學界得到了公認,但是,麻疹病毒囊膜蛋白是否具有誘導細胞凋亡功能,目前研究結果尚不一致。在本研究中,為研究麻疹病毒囊膜蛋白能否誘導其易感細胞凋亡,我們先用MV-H和MV-F蛋白的真核表達質粒pcDNA3.1-h和pHM6-f分別單獨轉染,或共轉染HeLa細胞,然后用一系列方法檢測了各實驗組細胞的形態(tài)學、生物化學變化。研究發(fā)現(xiàn),在單獨轉染了pcDNA3.1-h質粒,和共轉染了pcDNA3.1-h/pHM6-f質粒的HeLa細胞中,光鏡鏡檢可見細胞形態(tài)不規(guī)則,出現(xiàn)了變圓、固縮、脫壁等凋亡現(xiàn)象；MTT檢測發(fā)現(xiàn)細胞存活率顯著降低；Hoechst33258染色分析發(fā)現(xiàn)細胞出現(xiàn)核染色質固縮、凝聚、核碎裂等變化；DNA提取及瓊脂糖凝膠電泳分析發(fā)現(xiàn)細胞DNA片段化,形成了典型的"DNA ladder";Annexin-V/PI雙染分析發(fā)現(xiàn)細胞凋亡率明顯增加。而單獨轉染了pHM6-f質粒的HeLa細胞,及陰性對照組細...

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【學位級別】：博士

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論文創(chuàng)新點
中文摘要
Abstract
第一章 麻疹病毒相關研究進展
    (一) 麻疹病毒的生物學特征
        1.1 前言
        1.2 麻疹病毒的分類學定位
        1.3 麻疹病毒粒子的形態(tài)
        1.4 麻疹病毒基因組
        1.5 麻疹病毒基因組編碼蛋白的結構與功能
            1.5.1 核衣殼蛋白
            1.5.2 P、C、V蛋白
            1.5.3 基質蛋白
            1.5.4 融合蛋白
            1.5.5 血凝素蛋白
            1.5.6 L蛋白
        1.6 麻疹病毒的受體
            1.6.1 CD46
            1.6.2 SLAM
            1.6.3 Nectin-4
        1.7 麻疹病毒感染和復制周期
            1.7.1 病毒粒子的吸附、侵入和脫殼
            1.7.2 病毒基因的轉錄和翻譯
            1.7.3 病毒基因組的復制
            1.7.4 病毒粒子的裝配和釋放
        1.8 麻疹病毒在人體內感染和釋放途徑
        1.9 麻疹病毒的分子流行病毒學
        1.10 麻疹病毒感染與機體的免疫反應
            1.10.1 麻疹病毒感染與免疫應答反應
            1.10.2 麻疹病毒感染后的免疫抑制反應
        1.11 麻疹病毒在腫瘤基因治療方面的應用
            1.11.1 減毒疫苗株麻疹病毒和腫瘤基因治療
            1.11.2 重組溶瘤麻疹病毒和腫瘤基因治療
            1.11.3 麻疹病毒表達的相關蛋白和腫瘤基因治療
    (二) 病毒感染和細胞凋亡
        1.12 細胞凋亡的概念
        1.13 細胞凋亡的信號轉導途徑
            1.13.1 死亡配體/受體信號轉導途徑
            1.13.2 線粒體介導的細胞凋亡信號轉導途徑
            1.13.3 內質網介導的細胞凋亡信號轉導途徑
            1.13.4 三條細胞凋亡信號轉導途徑間的交義對話
        1.14 病毒感染與細胞凋亡
            1.14.1 病毒感染誘發(fā)細胞凋亡
            1.14.2 病毒感染抑制細胞凋亡
        1.15 本工作的研究背景和研究目的
第二章 麻疹病毒血凝素蛋白H誘導HeLa細胞凋亡
    摘要
    2.1 前言
    2.2 材料和方法
        2.2.1 細胞、質粒、抗體和試劑
        2.2.2 脂質體介導的質粒DNA對HeLa細胞的轉染
        2.2.3 MTT法檢測細胞存活率
        2.2.4 細胞形態(tài)鏡檢
        2.2.5 DNA片段化分析(“DNA ladder”檢測)
        2.2.6 Hoechst 33258染色分析
        2.2.7 Annexin-V/PI雙染法檢測細胞凋亡
        2.2.8 細胞表面蛋白的流式細胞術(Flow cytometry)定量分析
        2.2.9 Western blot分析
        2.2.10 統(tǒng)計分析
    2.3 研究結果
        2.3.1 MV-H和MV-F蛋白在HeLa細胞中的表達
        2.3.2 MV-H蛋白降低了HeLa細胞的存活率
        2.3.3 MV-H蛋白誘導HeLa細胞凋亡的細胞形態(tài)學觀察
        2.3.4 MV-H蛋白誘導HeLa細胞凋亡的細胞核形態(tài)變化
        2.3.5 MV-H蛋白誘導的HeLa細胞DNA片段化
        2.3.6 MV-H蛋白誘導HeLa細胞凋亡的Annexin-V/PI雙染分析
    2.4 討論
第三章 MV-H蛋白誘導HeLa細胞凋亡的分子機制
    摘要
    3.1 前言
    3.2 材料和方法
        3.2.1 細胞、質粒、抗體和試劑
        3.2.2 細胞培養(yǎng)和質粒轉染
        3.2.3 Annexin-V/PI雙染法檢測凋亡
        3.2.4 Western blot分析
        3.2.5 細胞表面蛋白的流式細胞儀定量分析
        3.2.6 線粒體跨膜電位(△Ψm)的測定
        3.2.7 線粒體組分和細胞質組分的分離
        3.2.8 Caspases活性檢測
        3.2.9 細胞凋亡抑制試驗
        3.2.10 統(tǒng)計分析
    3.3 研究結果
        3.3.1 MV-H蛋白上調了細胞TRAIL和DR5的表達
        3.3.2 TRAIL-R2：Fc抑制了MV-H蛋白誘導的細胞凋亡
        3.3.3 MV-H蛋白誘導了細胞線粒體跨膜電位(△Ψm)下降
        3.3.4 MV-H蛋白誘導了線粒體中Cyto-C和AIF的釋放
        3.3.5 MV-H蛋白誘導了Bax表達上調及其轉位
        3.3.6 MV-H蛋白誘導了caspases和PARP的切割
        3.3.7 Caspase-9、caspase-8和caspase-3的活性檢測結果
        3.3.8 Caspase抑制劑抑制了MV-H蛋白誘導的細胞凋亡
        3.3.9 MV-H誘導的細胞凋亡通路中,存在著死亡受體途徑和線粒體途徑間的交叉對話
    3.4 討論
第四章 H-CD46相互作用介導了MV-H蛋白誘導的HeLa細胞凋亡
    摘要
    4.1 前言
    4.2 材料和方法
        4.2.1 細胞、質粒、抗體和試劑
        4.2.2 細胞培養(yǎng)和質粒轉染
        4.2.3 用Annexin-V/PI雙染法檢測細胞凋亡
        4.2.4 Western blot分析
        4.2.5 用流式細胞儀定量分析細胞表面蛋白
        4.2.6 線粒體跨膜電位(△Ψm)的分析
        4.2.7 線粒體及細胞質組分的分離
        4.2.8 Caspases活性檢測
        4.2.9 細胞凋亡抑制試驗
        4.2.10 統(tǒng)計分析
    4.3 研究結果
        4.3.1 MV-H蛋白誘導了HeLa細胞的直接凋亡和“旁路凋亡”
        4.3.2 MV-H蛋白上調了H蛋白陽性細胞和H蛋白陰性細胞的TRAIL和DR 的表達
        4.3.3 anti-CD46和anti-MV-H抗體抑制了MV-H蛋白誘導的細胞凋亡
        4.3.4 anti-CD46和anti-MV-H抗體抑制了MV-H蛋白誘導的TRAIL/DR5的表達上調
        4.3.5 anti-CD46和anti-MV-H抗體抑制了MV-H蛋白誘導的△Ψm下降
        4.3.6 anti-CD46和anti-MV-H抗體抑制了MV-H誘導的caspases活化
    4.4 討論
論文總結
參考文獻
博士期間發(fā)表和待發(fā)表的文章
致謝



本文編號：3981360