麻疹病毒囊膜蛋白由血凝素蛋白(MV-H)和融合蛋白(MV-F)組成,它與易感細(xì)胞表面上的病毒受體蛋白結(jié)合介導(dǎo)了麻疹病毒的侵染。盡管麻疹病毒囊膜蛋白能誘使麻疹感染患者出現(xiàn)免疫抑制這一現(xiàn)象已經(jīng)在科學(xué)界得到了公認(rèn),但是,麻疹病毒囊膜蛋白是否具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡功能,目前研究結(jié)果尚不一致。在本研究中,為研究麻疹病毒囊膜蛋白能否誘導(dǎo)其易感細(xì)胞凋亡,我們先用MV-H和MV-F蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-h和pHM6-f分別單獨轉(zhuǎn)染,或共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,然后用一系列方法檢測了各實驗組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)變化。研究發(fā)現(xiàn),在單獨轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1-h質(zhì)粒,和共轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1-h/pHM6-f質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞中,光鏡鏡檢可見細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,出現(xiàn)了變圓、固縮、脫壁等凋亡現(xiàn)象；MTT檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活率顯著降低；Hoechst33258染色分析發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)核染色質(zhì)固縮、凝聚、核碎裂等變化；DNA提取及瓊脂糖凝膠電泳分析發(fā)現(xiàn)細(xì)胞DNA片段化,形成了典型的"DNA ladder";Annexin-V/PI雙染分析發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡率明顯增加。而單獨轉(zhuǎn)染了pHM6-f質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞,及陰性對照組細(xì)...

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【學(xué)位級別】：博士

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論文創(chuàng)新點
中文摘要
Abstract
第一章 麻疹病毒相關(guān)研究進(jìn)展
    (一) 麻疹病毒的生物學(xué)特征
        1.1 前言
        1.2 麻疹病毒的分類學(xué)定位
        1.3 麻疹病毒粒子的形態(tài)
        1.4 麻疹病毒基因組
        1.5 麻疹病毒基因組編碼蛋白的結(jié)構(gòu)與功能
            1.5.1 核衣殼蛋白
            1.5.2 P、C、V蛋白
            1.5.3 基質(zhì)蛋白
            1.5.4 融合蛋白
            1.5.5 血凝素蛋白
            1.5.6 L蛋白
        1.6 麻疹病毒的受體
            1.6.1 CD46
            1.6.2 SLAM
            1.6.3 Nectin-4
        1.7 麻疹病毒感染和復(fù)制周期
            1.7.1 病毒粒子的吸附、侵入和脫殼
            1.7.2 病毒基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯
            1.7.3 病毒基因組的復(fù)制
            1.7.4 病毒粒子的裝配和釋放
        1.8 麻疹病毒在人體內(nèi)感染和釋放途徑
        1.9 麻疹病毒的分子流行病毒學(xué)
        1.10 麻疹病毒感染與機體的免疫反應(yīng)
            1.10.1 麻疹病毒感染與免疫應(yīng)答反應(yīng)
            1.10.2 麻疹病毒感染后的免疫抑制反應(yīng)
        1.11 麻疹病毒在腫瘤基因治療方面的應(yīng)用
            1.11.1 減毒疫苗株麻疹病毒和腫瘤基因治療
            1.11.2 重組溶瘤麻疹病毒和腫瘤基因治療
            1.11.3 麻疹病毒表達(dá)的相關(guān)蛋白和腫瘤基因治療
    (二) 病毒感染和細(xì)胞凋亡
        1.12 細(xì)胞凋亡的概念
        1.13 細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑
            1.13.1 死亡配體/受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑
            1.13.2 線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑
            1.13.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑
            1.13.4 三條細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑間的交義對話
        1.14 病毒感染與細(xì)胞凋亡
            1.14.1 病毒感染誘發(fā)細(xì)胞凋亡
            1.14.2 病毒感染抑制細(xì)胞凋亡
        1.15 本工作的研究背景和研究目的
第二章 麻疹病毒血凝素蛋白H誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡
    摘要
    2.1 前言
    2.2 材料和方法
        2.2.1 細(xì)胞、質(zhì)粒、抗體和試劑
        2.2.2 脂質(zhì)體介導(dǎo)的質(zhì)粒DNA對HeLa細(xì)胞的轉(zhuǎn)染
        2.2.3 MTT法檢測細(xì)胞存活率
        2.2.4 細(xì)胞形態(tài)鏡檢
        2.2.5 DNA片段化分析(“DNA ladder”檢測)
        2.2.6 Hoechst 33258染色分析
        2.2.7 Annexin-V/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡
        2.2.8 細(xì)胞表面蛋白的流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry)定量分析
        2.2.9 Western blot分析
        2.2.10 統(tǒng)計分析
    2.3 研究結(jié)果
        2.3.1 MV-H和MV-F蛋白在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)
        2.3.2 MV-H蛋白降低了HeLa細(xì)胞的存活率
        2.3.3 MV-H蛋白誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
        2.3.4 MV-H蛋白誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的細(xì)胞核形態(tài)變化
        2.3.5 MV-H蛋白誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞DNA片段化
        2.3.6 MV-H蛋白誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的Annexin-V/PI雙染分析
    2.4 討論
第三章 MV-H蛋白誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的分子機制
    摘要
    3.1 前言
    3.2 材料和方法
        3.2.1 細(xì)胞、質(zhì)粒、抗體和試劑
        3.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
        3.2.3 Annexin-V/PI雙染法檢測凋亡
        3.2.4 Western blot分析
        3.2.5 細(xì)胞表面蛋白的流式細(xì)胞儀定量分析
        3.2.6 線粒體跨膜電位(△Ψm)的測定
        3.2.7 線粒體組分和細(xì)胞質(zhì)組分的分離
        3.2.8 Caspases活性檢測
        3.2.9 細(xì)胞凋亡抑制試驗
        3.2.10 統(tǒng)計分析
    3.3 研究結(jié)果
        3.3.1 MV-H蛋白上調(diào)了細(xì)胞TRAIL和DR5的表達(dá)
        3.3.2 TRAIL-R2：Fc抑制了MV-H蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡
        3.3.3 MV-H蛋白誘導(dǎo)了細(xì)胞線粒體跨膜電位(△Ψm)下降
        3.3.4 MV-H蛋白誘導(dǎo)了線粒體中Cyto-C和AIF的釋放
        3.3.5 MV-H蛋白誘導(dǎo)了Bax表達(dá)上調(diào)及其轉(zhuǎn)位
        3.3.6 MV-H蛋白誘導(dǎo)了caspases和PARP的切割
        3.3.7 Caspase-9、caspase-8和caspase-3的活性檢測結(jié)果
        3.3.8 Caspase抑制劑抑制了MV-H蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡
        3.3.9 MV-H誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路中,存在著死亡受體途徑和線粒體途徑間的交叉對話
    3.4 討論
第四章 H-CD46相互作用介導(dǎo)了MV-H蛋白誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞凋亡
    摘要
    4.1 前言
    4.2 材料和方法
        4.2.1 細(xì)胞、質(zhì)粒、抗體和試劑
        4.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
        4.2.3 用Annexin-V/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡
        4.2.4 Western blot分析
        4.2.5 用流式細(xì)胞儀定量分析細(xì)胞表面蛋白
        4.2.6 線粒體跨膜電位(△Ψm)的分析
        4.2.7 線粒體及細(xì)胞質(zhì)組分的分離
        4.2.8 Caspases活性檢測
        4.2.9 細(xì)胞凋亡抑制試驗
        4.2.10 統(tǒng)計分析
    4.3 研究結(jié)果
        4.3.1 MV-H蛋白誘導(dǎo)了HeLa細(xì)胞的直接凋亡和“旁路凋亡”
        4.3.2 MV-H蛋白上調(diào)了H蛋白陽性細(xì)胞和H蛋白陰性細(xì)胞的TRAIL和DR 的表達(dá)
        4.3.3 anti-CD46和anti-MV-H抗體抑制了MV-H蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡
        4.3.4 anti-CD46和anti-MV-H抗體抑制了MV-H蛋白誘導(dǎo)的TRAIL/DR5的表達(dá)上調(diào)
        4.3.5 anti-CD46和anti-MV-H抗體抑制了MV-H蛋白誘導(dǎo)的△Ψm下降
        4.3.6 anti-CD46和anti-MV-H抗體抑制了MV-H誘導(dǎo)的caspases活化
    4.4 討論
論文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
博士期間發(fā)表和待發(fā)表的文章
致謝



本文編號：3981360