本文關(guān)鍵詞：銅綠假單胞菌鐵載體pyoverdine在周質(zhì)空間合成途徑中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：銅綠假單胞菌是一種條件致病菌,能夠在醫(yī)院中引起10%-20%的感染,一旦感染,普通的抗生素很難根除,而且死亡率很高,因此,預(yù)防銅綠假單胞菌感染,是非常重要的。銅綠假單胞菌一個(gè)重要的致病因素就是一種能夠螯合鐵的小分子物質(zhì)-鐵載體。 一直以來,鐵載體作為微生物獲得鐵的主要方式,它的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究具有重要理論意義與實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。在銅綠假單胞菌中有兩種比較重要的鐵載體,一種為pyochelin螯鐵蛋白,另一種為pyoverdine(PVD)水溶性熒光素鐵載體。由于所有類型的PVD都具有同樣的高度保守的熒光基團(tuán),上述蛋白在各種熒光假單胞菌中也是高度保守的,因此我們期望通過X射線晶體學(xué)的方法來解析合成PVD的一系列酶分子結(jié)構(gòu),為抗銅綠假單胞菌的高效、專一性藥物的設(shè)計(jì)提供新的靶點(diǎn)。 銅綠假單胞菌PAO1的PVDI是pyoverdine研究的原型,己發(fā)現(xiàn)十幾種基因參與其合成。在本論文是以與PVDI成熟過程中相關(guān)的蛋白質(zhì)為研究對(duì)象的。PVD的成熟過程如下：在細(xì)胞質(zhì)中,在NRPS催化下ferribactin前體合成,ferribactin同時(shí)攜帶不成熟的發(fā)色團(tuán)(chromophore),在PvdE作用下轉(zhuǎn)運(yùn)到周質(zhì)空間,在PvdN、O、P、Q以及其它未知蛋白作用下,完成PVDI的合成,此時(shí)PVDI具有熒光基團(tuán),即合成了成熟的chromophore,在未知轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作用下轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外。 為了闡明PvdN、PvdO以及PvdP在PVD成熟途徑中的作用,本文使用分子生物學(xué)的方法克隆表達(dá)和純化了PvdO以及PvdN的native蛋白質(zhì)和硒代蛋白質(zhì),并進(jìn)行了晶體生長(zhǎng)和優(yōu)化,得到良好的單晶,在SSRF收集并處理了數(shù)據(jù),用CCP4, COOT, Phenix及CNS等結(jié)構(gòu)生物學(xué)軟件解析了PvdO以及PvdN的結(jié)構(gòu)。通過分子生物學(xué)的方法也克隆表達(dá)和純化了PvdP的蛋白質(zhì),并進(jìn)行了晶體的生長(zhǎng)和優(yōu)化,也得到了晶型比較好的單晶,但是不能夠拿到晶體的數(shù)據(jù)。通過對(duì)PvdO以及PvdN的結(jié)構(gòu)分析,設(shè)計(jì)了相對(duì)應(yīng)的功能實(shí)驗(yàn),期望能夠獲得PvdO以及PvdN的催化機(jī)制。
【關(guān)鍵詞】：銅綠假單胞菌 鐵載體PVD 結(jié)構(gòu) 催化機(jī)制
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R378.991
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 符號(hào)說明10-11
• 第一章 前言11-23
• 1.1 鐵載體11-12
• 1.1.1 鐵載體定義11-12
• 1.1.2 鐵載體合成途徑12
• 1.1.3 鐵載體重要功能12
• 1.2 銅綠假單胞菌12-17
• 1.2.1 銅綠假單胞菌生物學(xué)特性12-13
• 1.2.2 銅綠假單胞菌的鐵載體13-14
• 1.2.3 銅綠假單胞菌對(duì)人類的威脅14
• 1.2.4 PvdI的合成途徑14-17
• 1.3 本文的主要內(nèi)容、目的、意義及創(chuàng)新點(diǎn)17-23
• 1.3.1 蛋白質(zhì)生物學(xué)分析17-20
• 1.3.2 研究?jī)?nèi)容20
• 1.3.3 目的、意義20-21
• 1.3.4 創(chuàng)新21-23
• 第二章 蛋白的表達(dá)、純化與結(jié)晶23-59
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料23-28
• 2.1.1 菌株和質(zhì)粒23
• 2.1.2 試劑和工具酶23-24
• 2.1.3 常規(guī)儀器24
• 2.1.4 試劑24-28
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法28-38
• 2.2.1 PvdO表達(dá)載體的構(gòu)建28-33
• 2.2.2 PvdN表達(dá)載體的構(gòu)建33-34
• 2.2.3 PvdP表達(dá)載體的構(gòu)建34-35
• 2.2.4 蛋白的表達(dá)與純化35-38
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果38-50
• 2.3.1 PvdO的分離純化38-43
• 2.3.2 PvdP的分離純化43-46
• 2.3.3 PvdN的分離純化46-50
• 2.4 蛋白質(zhì)晶體的篩選、優(yōu)化50-56
• 2.4.1 引言50
• 2.4.2 實(shí)驗(yàn)材料50-51
• 2.4.3 蛋白質(zhì)的結(jié)晶51-53
• 2.4.4 PvdO的晶體53-55
• 2.4.5 PvdP的晶體55
• 2.4.6 PvdN的晶體55-56
• 2.5 本章小結(jié)56-59
• 第三章 解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)59-73
• 3.1 收集與處理衍射數(shù)據(jù)59
• 3.1.1 X射線的產(chǎn)生59
• 3.1.2 X射線晶體結(jié)構(gòu)分析的基本原理59
• 3.2 收集與處理衍射數(shù)據(jù)59-63
• 3.2.1 測(cè)試晶體衍射數(shù)據(jù)59-60
• 3.2.2 在SSRF上收集數(shù)據(jù)60
• 3.2.3 晶體的快速冷凍60
• 3.2.4 處理衍射數(shù)據(jù)60-62
• 3.2.5 數(shù)據(jù)處理的結(jié)果62-63
• 3.3 相位的確定63-67
• 3.3.1 相位問題63
• 3.3.2 相位確定的方法63-66
• 3.3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果66-67
• 3.4 電子密度圖的解析與模型構(gòu)建67-68
• 3.4.1 電子密度圖67-68
• 3.4.2 建立結(jié)構(gòu)模型68
• 3.5 修正結(jié)構(gòu)模型68-73
• 3.5.1 結(jié)構(gòu)修正的原理68-69
• 3.5.2 修正結(jié)構(gòu)的一般方法69-70
• 3.5.3 結(jié)構(gòu)修正的結(jié)果70-73
• 第四章 PvdO與PvdN結(jié)構(gòu)與功能的研究73-85
• 4.1 實(shí)驗(yàn)的理論技術(shù)和方法73-79
• 4.1.1 動(dòng)態(tài)光散射(DLS)73-75
• 4.1.2 等溫滴定量熱法(ITC)75-76
• 4.1.3 差示掃描量熱法(DSC)76-79
• 4.2 晶體結(jié)構(gòu)與功能描述79-83
• 4.2.1 PvdO晶體結(jié)構(gòu)與功能79-82
• 4.2.2 PvdN晶體結(jié)構(gòu)與功能82-83
• 4.3 本章總結(jié)83-85
• 全文總結(jié)和討論85-87
• 參考文獻(xiàn)87-95
• 致謝95-96
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表96

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 梁建根;郝中娜;王連平;陶榮祥;鄭經(jīng)武;;嗜鐵素功能研究概述[J];中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào);2011年05期

  本文關(guān)鍵詞：銅綠假單胞菌鐵載體pyoverdine在周質(zhì)空間合成途徑中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：397887