發(fā)布時間：2017-05-26 19:11

  本文關(guān)鍵詞：化膿性鏈球菌htrA與蛋白分泌相關(guān)性初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：化膿性鏈球菌為革蘭氏陽性人類專性致病菌,可引起從輕微的皮膚化膿性感染(膿皰病)和咽炎,到危及生命的壞死性筋膜炎,鏈球菌侵襲性感染如中毒性休克綜合征等疾病,反復(fù)的化膿性鏈球菌感染可引起嚴重的包括急性風(fēng)濕熱和腎小球腎炎等的免疫后遺癥。其致病性是由其分泌的毒力和侵襲性酶所致,其中鏈球菌溶血素,致熱外毒素B是引起化膿性鏈球菌感染性疾病的重要毒素。Caparon等認為化膿性鏈球菌通過一個稱為"ExPortal"微結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)進行包括毒力因子在內(nèi)的蛋白的分泌與運輸。目前證實鏈球菌致熱外毒素B,溶血素是通過該結(jié)構(gòu)域進行分泌與成熟的,而HtrA作為蛋白質(zhì)分泌分子伴侶在該結(jié)構(gòu)域高濃度聚集,因此推測HtrA參與化膿性鏈球菌蛋白的分泌過程。 本研究用溫度敏感自殺質(zhì)粒/電轉(zhuǎn)化方法,構(gòu)建htrA基因跨膜結(jié)構(gòu)域缺失突變株SPD14和htrA跨膜結(jié)構(gòu)域缺失補償株SPC15以及htrA基因壯觀霉素插入突變株SPI28,以化膿性鏈球菌的兩個重要胞外毒素——鏈球菌溶血素和致熱外毒素B為研究對象,研究化膿性鏈球菌htrA基因缺失對胞外毒素活性和分泌的影響,血平板分析溶血素活性實驗結(jié)果表明,htrA基因跨膜結(jié)構(gòu)域缺失突變和htrA基因壯觀霉素插入突變下調(diào)化膿性鏈球菌溶血素的活性。酪素平板分析SpeB活性結(jié)果顯示,無論是htrA基因跨膜結(jié)構(gòu)域缺失突變,還是htrA基因插入突變都推遲SpeB活性形成。用SDS-PAGE垂直電泳分析菌株培養(yǎng)上清液中胞外蛋白SpeB的含量結(jié)果發(fā)現(xiàn),與野生型菌株SPXL1、htrA基因壯觀霉素插入突變株SPI28和htrA跨膜結(jié)構(gòu)域缺失補償株SPC15相比較,htrA基因跨膜結(jié)構(gòu)域缺失影響SpeB蛋白的分泌與成熟。用堿性磷酸酶表達載體研究htrA基因缺失對堿性磷酸酶分泌影響實驗發(fā)現(xiàn),攜帶堿性磷酸酶表達載體的htrA基因跨膜結(jié)構(gòu)域缺失突變株SPZ7和htrA基因壯觀霉素插入突變株SPZ36的胞外堿性磷酸酶(PhoZ)活性分別是野生型菌株SPZ35的85%和106%,這表明htrA基因跨膜結(jié)構(gòu)域可能會影響堿性磷酸酶分泌�；撔枣溓蚓鷦游锛毎恼掣綄嶒灲Y(jié)果發(fā)現(xiàn),SPD14對細胞的粘附只有野生型的9.6%,而SPI28對細胞的粘附性與野生型相差不大,考慮到htrA基因跨膜結(jié)構(gòu)域缺失會影響蛋白的分泌,htrA基因跨膜結(jié)構(gòu)域缺失對細胞的粘附影響可能與htrA基因跨膜結(jié)構(gòu)域缺失株表面與宿主細胞粘附有關(guān)因子的減少有關(guān)。 本實驗研究結(jié)果表明,htrA基因影響化膿性鏈球菌的溶血素和致熱外毒素B的活性,htrA基因跨膜結(jié)構(gòu)域影響SpeB的分泌,胞外堿性磷酸酶活性以及對宿主細胞的粘附,我們推測化膿性鏈球菌htrA基因跨膜結(jié)構(gòu)域參與蛋白的分泌,htrA基因跨膜結(jié)構(gòu)域可能足化膿性鏈球菌蛋白分泌‘ExPortaⅠ”結(jié)構(gòu)組成成分,研究結(jié)果對化膿性鏈球菌毒力因子的轉(zhuǎn)運及致病機理研究將起到積極的作用,或許在基于蛋白分泌與轉(zhuǎn)運方面,找到藥物篩選的新靶點。
【關(guān)鍵詞】：化膿性鏈球菌 htrA基因 跨膜結(jié)構(gòu)域缺失突變株 溶血素 致熱外毒素B
【學(xué)位授予單位】：西南交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R378.12
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-13
• 第一章 緒論13-23
• 1.1 概述13
• 1.2 化膿性鏈球菌感染的診斷13-15
• 1.3 化膿性鏈球菌的致病機理15-16
• 1.3.1 粘附素15
• 1.3.2 鏈球菌溶血素O(SLO)15
• 1.3.3 鏈球菌溶血素S(SLS)15-16
• 1.3.4 致熱性外毒素(SPE)16
• 1.3.5 M蛋白16
• 1.4 化膿性鏈球菌與致熱性外毒素SpeB16-18
• 1.4.1 SpeB的結(jié)構(gòu)與表達調(diào)控16-17
• 1.4.2 SpeB與細胞凋亡17
• 1.4.3 SpeB與化膿性鏈球菌感染17-18
• 1.5 HtrA絲氨酸蛋白酶基因?qū)撔枣溓蚓鶶peB的影響18-20
• 1.6 課題的研究內(nèi)容與意義20-22
• 1.7 實驗技術(shù)路線22-23
• 第二章 htrA基因突變株的構(gòu)建23-48
• 2.1 實驗材料23-25
• 2.1.1 菌種與質(zhì)粒23
• 2.1.2 實驗試劑與儀器23-24
• 2.1.3 培養(yǎng)基與溶劑24-25
• 2.2 實驗方法25-38
• 2.2.1 化膿性鏈球菌SPXL1基因組DNA的提取25-26
• 2.2.2 DH5α感受態(tài)細胞的制作26
• 2.2.3 溫度敏感型質(zhì)粒pJRS700質(zhì)粒的提取26-27
• 2.2.4 SPXL1感受態(tài)細胞的制備27-28
• 2.2.5 htrA基因跨膜結(jié)構(gòu)域缺失突變株的構(gòu)建28-34
• 2.2.6 htrA基因跨膜結(jié)構(gòu)域缺失突變株的確認34-36
• 2.2.7 htrA基因跨膜結(jié)構(gòu)域缺失補償株的構(gòu)建36
• 2.2.8 跨膜結(jié)構(gòu)域缺失補償株構(gòu)建的確認36
• 2.2.9 htrA基因插入突變株的構(gòu)建36-38
• 2.3 實驗結(jié)果與討論38-46
• 2.3.1 PCR擴增htrA基因38-39
• 2.3.2 ClaⅠ酶切PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒載體pJRS70039-40
• 2.3.3 htrA基因載體pXL22(pJRS700-htrA)的構(gòu)建40-41
• 2.3.4 htrA基因缺失質(zhì)粒pXL44的構(gòu)建41
• 2.3.5 htrA基因跨膜結(jié)構(gòu)域缺失突變株的篩選與確認41-43
• 2.3.6 htrA基因跨膜結(jié)構(gòu)域缺失補償株的構(gòu)建43-44
• 2.3.7 PCR擴增spec表達盒44
• 2.3.8 SpeⅠ酶切PCR產(chǎn)物和pXL22質(zhì)粒44-45
• 2.3.9 pXL43質(zhì)粒的構(gòu)建45
• 2.3.10 htrA基因插入突變株的構(gòu)建45-46
• 2.4 本章小結(jié)46-48
• 第三章 htrA基因跨膜結(jié)構(gòu)域缺失對GAS毒素的影響48-53
• 3.1 實驗材料48-49
• 3.1.1 實驗菌種48
• 3.1.2 實驗儀器與試劑48
• 3.1.3 培養(yǎng)基與溶劑48-49
• 3.2 實驗方法49
• 3.2.1 htrA基因?qū)AS溶血素活性的影響49
• 3.2.2 htrA基因?qū)χ聼嵬舛舅谺活性的影響49
• 3.3 實驗結(jié)果49-51
• 3.3.1 溶血素活性實驗結(jié)果49-50
• 3.3.2 htrA基因?qū)χ聼嵬舛舅谺活性的影響結(jié)果50-51
• 3.4 本章小結(jié)51-53
• 第四章 htrA對GAS蛋白分泌的影響53-67
• 4.1 實驗材料53-55
• 4.1.1 實驗菌種53
• 4.1.2 實驗試劑與儀器53-54
• 4.1.3 培養(yǎng)基與溶劑54-55
• 4.2 實驗方法55-60
• 4.2.1 htrA基因?qū)peB蛋白酶分泌的影響55-57
• 4.2.2 htrA基因?qū)A性磷酸酶分泌的影響57-59
• 4.2.3 細胞粘附性實驗59-60
• 4.3 實驗結(jié)果60-65
• 4.3.1 htrA基因?qū)Φ鞍追置谟绊憣嶒灲Y(jié)果60-63
• 4.3.2 htrA基因?qū)ν庠吹鞍讐A性磷酸酶分泌的影響63-64
• 4.3.3 細胞粘附性實驗64-65
• 4.4 本章小結(jié)65-67
• 結(jié)論67-69
• 致謝69-70
• 參考文獻70-75
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文及科研成果75

【參考文獻】

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本文編號：397819