發(fā)布時(shí)間：2017-05-25 14:08

  本文關(guān)鍵詞：白色念珠菌H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶N端肽段的原核表達(dá)及應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：近年來(lái),隨著大量免疫抑制劑、化療藥物和廣譜抗生素的廣泛應(yīng)用,侵襲性念珠菌感染(invasive candidiasis, IC)的發(fā)病率和死亡率不斷上升。但因缺乏特異的臨床癥狀,且血培養(yǎng)和組織病理學(xué)檢查這兩種確診方法缺乏敏感性,往往延誤治療,因此亟需更快速、敏感的方法用于IC的診斷。國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)把注意力集中于用血清學(xué)方法檢測(cè)患者血液中的白念珠茵特異性抗原、抗體及代謝產(chǎn)物上。研究表明白色念珠菌H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶是IC血清學(xué)診斷中的一個(gè)候選抗原。 目的 原核表達(dá)白色念珠茵H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶N末端肽段(N-terminal region of histone3lysine4methyltransferase, Setl-208p),建立檢測(cè)人血清中抗Setl-208p IgG類抗體的ELISA方法,評(píng)估其在IC中的早期診斷價(jià)值。 方法 對(duì)GenBank報(bào)道的白色念珠菌H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶(histone3lysine4methyltransferase, Setlp)與其他物種H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行序列比對(duì),選擇與人類無(wú)同源性的抗原特異性片段,設(shè)計(jì)一對(duì)引物,以白色念珠茵C1標(biāo)準(zhǔn)株基因組DNA為模板,PCR擴(kuò)增Setl-208p的編碼基因,以pET28a(+)為載體,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)獲得重組菌,并用IPTG誘導(dǎo)重組蛋白質(zhì)表達(dá),Talon金屬親和柱層析純化后用抗his標(biāo)簽的單克隆抗體進(jìn)行鑒定。純化的Setl-208p一方面用于免疫家兔,制備多克隆抗體。另一方面用于建立檢測(cè)人血清中相應(yīng)IgG類抗體的ELISA方法,并評(píng)估其在家兔感染模型以及IC患者中早期診斷價(jià)值。 結(jié)果 成功克隆了白色念珠菌抗原特異性H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶片段Setl-208p基因,制備了相應(yīng)的工程菌株,誘導(dǎo)表達(dá)并獲得了純化的重組肽段,所得蛋白約為29kDa,帶有His標(biāo)簽,經(jīng)western blot鑒定表明誘導(dǎo)的重組蛋白可與IC病人血清發(fā)生特異性反應(yīng)；制備了針對(duì)白色念珠菌Setl-208p的兔抗血清,western blot結(jié)果顯示特異性良好;建立了檢測(cè)抗白色念珠茵抗Setl-208p抗體的ELISA方法,以該法檢測(cè)兔模型血清,在感染第4天開(kāi)始抗體陽(yáng)性,病人血清檢測(cè)結(jié)果顯示,該方法對(duì)IC的診斷敏感性為79.2%,特異性為90%,且與細(xì)菌感染及其他真菌感染病人(如曲霉)無(wú)非特異交叉反應(yīng)。 結(jié)論 成功表達(dá)了白色念珠菌H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶N末端肽段Setl-208p重組蛋白質(zhì),建立了檢測(cè)抗Setl-208p抗體的ELISA法,證明該方法對(duì)IC的診斷具有潛在應(yīng)用價(jià)值。
【關(guān)鍵詞】：白色念珠菌 H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶 原核表達(dá) 多克隆抗體 ELISA
【學(xué)位授予單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R379.4
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-7
• 英文縮略語(yǔ)表7-12
• 第一章 緒論12-19
• 1.1 侵襲性念珠菌感染診斷研究進(jìn)展12-17
• 1.1.1 直接鏡檢與培養(yǎng)法12
• 1.1.2 組織病理學(xué)檢查12-13
• 1.1.3 分子生物學(xué)方法13
• 1.1.4 血清學(xué)方法13-17
• 1.1.4.1 抗原檢測(cè)13-14
• 1.1.4.2 抗體檢測(cè)14-16
• 1.1.4.3 聯(lián)合檢測(cè)在診斷IC中的應(yīng)用16-17
• 1.2 白色念珠菌H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶17-19
• 第二章 白色念珠菌H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶N端肽段重組蛋白的制備19-36
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料19-24
• 2.1.1 PCR引物設(shè)計(jì)與合成19
• 2.1.2 質(zhì)粒與菌株19
• 2.1.3 二具酶及主要試劑19
• 2.1.4 血清來(lái)源19-20
• 2.1.5 主要溶液配制20-24
• 2.1.6 主要儀器24
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法24-30
• 2.2.1 白色念珠菌H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶N端肽段全長(zhǎng)基因的獲得24-25
• 2.2.2 克隆載體的構(gòu)建25-28
• 2.2.3 表達(dá)載體的構(gòu)建28
• 2.2.4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化、鑒定及抗原性分析28-30
• 2.3 結(jié)果30-34
• 2.3.1 蛋白質(zhì)氨基酸(aa)序列比對(duì)30-31
• 2.3.2 白色念珠菌Setl-208p全長(zhǎng)基因的PCR擴(kuò)增31-32
• 2.3.3 重組克隆載體、表達(dá)載體的鑒定32
• 2.3.4 重組蛋白的表達(dá)、鑒定及抗原性分析32-33
• 2.3.5 重組蛋白的純化33-34
• 2.4 討論34-36
• 第三章 檢測(cè)白色念珠菌H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶N端肽段抗體的ELISA方法建立36-40
• 3.1 主要試劑36
• 3.1.1 血清樣本36
• 3.1.2 主要試劑及儀器36
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法36-37
• 3.2.1 Setl-208p重組蛋白質(zhì)的制備36-37
• 3.2.2 ELISA方法建立37
• 3.2.3 方法學(xué)考核37
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果37-38
• 3.3.1 ELISA方法的建立37
• 3.3.2 ELISA方法學(xué)考核37-38
• 3.3.3 IC兔模型不同病程血清測(cè)定結(jié)果38
• 3.4 討論38-40
• 第四章 ELISA檢測(cè)抗白色念珠菌H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶N端肽段抗體在IC患者中的應(yīng)用40-49
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料40-41
• 4.1.1 標(biāo)本來(lái)源40
• 4.1.2 主要試劑及儀器40-41
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法41
• 4.2.1 ELISA方法建立41
• 4.2.2 cut-off值確定41
• 4.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析41
• 4.3 結(jié)果41-47
• 4.3.1 ELISA方法的建立41
• 4.3.2 cut off值確定41-42
• 4.3.3 抗Setl-208p抗體測(cè)定結(jié)果42-47
• 4.3.4 患者外周血WBC數(shù)對(duì)抗Setl-208p抗體水平的影響47
• 4.4 討論47-49
• 第五章 白色念珠菌H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶N端肽段多克隆抗體的制備及鑒定49-52
• 5.1 實(shí)驗(yàn)材料49
• 5.1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器及試劑49
• 5.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物49
• 5.2 實(shí)驗(yàn)方法49-50
• 5.2.1 重組抗原的準(zhǔn)備49
• 5.2.2 免疫方法49-50
• 5.2.3 ELISA法測(cè)定免疫兔血清效價(jià)50
• 5.2.4 雙向免疫擴(kuò)散50
• 5.2.5 western blot分析50
• 5.3 結(jié)果50-51
• 5.3.1 效價(jià)測(cè)定50
• 5.3.2 向免疫擴(kuò)散50
• 5.3.3 western blot分析50-51
• 5.4 討論51-52
• 第六章 主要結(jié)論及展望52-53
• 6.1 主要結(jié)論52
• 6.2 展望52-53
• 參考文獻(xiàn)53-57
• 研究生期間論文發(fā)表及參加會(huì)議情況57-58
• 致謝58

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