本文關(guān)鍵詞：Ephrin-B2對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響及其蛋白質(zhì)組學(xué)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的在蛋白質(zhì)組學(xué)水平上研究ephrin-B2對(duì)人靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)蛋白質(zhì)表達(dá)的影響,探索其參與的主要的生物功能和信號(hào)通路及可能作用機(jī)制。并探究ephrin-B2對(duì)HUVECs增殖、遷移的作用和對(duì)細(xì)胞周期的影響以及增殖存活相關(guān)蛋白表達(dá)的變化,確證蛋白質(zhì)組學(xué)的研究,為在蛋白質(zhì)組水平上探討ephrin-B2對(duì)HUVECs細(xì)胞功能和信號(hào)通路的影響以及對(duì)細(xì)胞增殖遷移的作用機(jī)制研究提供新的思路,并為探究它在心肌缺血中的重要性和將來(lái)成為血管生成方面的治療劑的候選蛋白提供科學(xué)研究依據(jù)。 方法用酶消化揉搓法提取原代HUVECs并進(jìn)行培養(yǎng)和傳代,運(yùn)用SILAC同位素標(biāo)記技術(shù)對(duì)培養(yǎng)的HUVECs進(jìn)行標(biāo)記,分別以1μg/mL的ephrin-B2/Fc和PBS處理標(biāo)記的HUVECs15h,分別提取處理組和對(duì)照組蛋白后以1：1混合,運(yùn)用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)HUVECs內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)的變化,IPA軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析,分析其參與的生物功能、經(jīng)典信號(hào)通路、相互作用網(wǎng)絡(luò)等,并預(yù)測(cè)其下游效應(yīng)；用Western Blot技術(shù)檢測(cè)增殖存活相關(guān)蛋白表達(dá)的變化；用cck-8法在既定的時(shí)間點(diǎn)(1、3、5、7d)觀察不同濃度的ephrin-B2/Fc(0、0.01、0.03.0.1、0.3、1μg/mL)對(duì)HUVECs增殖的影響(各組n=6),運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)觀察該蛋白對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞周期的影響,并運(yùn)用Transwell和劃痕試驗(yàn)觀察不同濃度的ephrin-B2/Fc(0.0.1、0.3、1、3μg/mL)對(duì)HUVECs遷移的作用,從而觀察其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞血管新生的調(diào)控。 結(jié)果蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果顯示,ephrin-B2/Fc處理后,HUVECs內(nèi)細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)明顯上調(diào),細(xì)胞存活、增殖、遷移相關(guān)多條信號(hào)通路激活,預(yù)測(cè)其具有減少細(xì)胞凋亡、自噬,促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和運(yùn)動(dòng)的作用；WB結(jié)果顯示,ephrin-B2/Fc促進(jìn)了細(xì)胞存活、增殖相關(guān)蛋白Bcl-2、c-Myc、NPM表達(dá)的上調(diào),而凋亡相關(guān)蛋白BAX表達(dá)亦有所上調(diào)。增殖遷移結(jié)果顯示,ephrin-B2/Fc促進(jìn)HUVECs的增殖,并呈濃度依賴性增加；在0～1μg/mL的濃度范圍內(nèi),ephrin-B2/Fc對(duì)HUVECs的遷移作用呈濃度依賴性促進(jìn),但當(dāng)濃度為3μg/mL時(shí)其促遷移作用消失；流式細(xì)胞結(jié)果分析顯示1μg/mL ephrin-B2/Fc處理組,G0/G1期細(xì)胞比例顯著降低(P0.05),S期細(xì)胞比例增高(P0.05)。 結(jié)論Ephrin-B2上調(diào)HUVECs內(nèi)細(xì)胞骨架蛋白、增殖存活相關(guān)蛋白的表達(dá),激活增殖遷移相關(guān)信號(hào)通路,參與細(xì)胞存活、增殖、遷移等細(xì)胞功能的發(fā)揮,促使細(xì)胞由G0/G1期進(jìn)入S期。在一定濃度范圍內(nèi)ephrin-B2促進(jìn)了HUVECs的增殖和遷移,當(dāng)超過一定濃度,其促遷移作用消失。
【關(guān)鍵詞】：ephrin-B2/Fc 增殖 遷移 蛋白質(zhì)組 質(zhì)譜
【學(xué)位授予單位】：廈門大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-14
• 第一章 前言14-20
• 1.1 心肌梗死(Myocardial Infarction,MI)治療研究現(xiàn)狀14
• 1.2 Eph/ephrin家族與血管生成14-16
• 1.2.1 血管生成14-15
• 1.2.2 Eph/ephrin系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的特殊性15-16
• 1.2.3 Ephrin-B2的生物功能及其對(duì)血管生成的重要性16
• 1.2.4 Ephrin-B2/EphB4雙向信號(hào)對(duì)血管新生影響的爭(zhēng)議16
• 1.3 ephrin-B2與心梗治療16-17
• 1.4 蛋白質(zhì)組學(xué)研究17-19
• 1.4.1 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的必要性17
• 1.4.2 質(zhì)譜技術(shù)與SILAC標(biāo)記技術(shù)17-18
• 1.4.3 IPA分析平臺(tái)18-19
• 1.5 研究的創(chuàng)新性19-20
• 第二章 試劑、材料與主要儀器20-24
• 2.1 試劑和材料20
• 2.2 生物材料20
• 2.3 常用試劑配制20-22
• 2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)常用試劑20-21
• 2.3.2 Western blot試劑配制21-22
• 2.3.3 蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析試劑的配制22
• 2.4 主要儀器22-24
• 第三章 實(shí)驗(yàn)方法24-38
• 3.1 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定24-26
• 3.1.1 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分離方法24-25
• 3.1.2 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞傳代培養(yǎng)25
• 3.1.3 人Ⅷ因子相關(guān)抗原檢測(cè)25-26
• 3.2 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析ephrin-B2/Fc對(duì)HUVECs的蛋白質(zhì)組學(xué)影響26-31
• 3.2.1 穩(wěn)定的同位素標(biāo)記26
• 3.2.2 蛋白樣品的制備(細(xì)胞處理,裂解和SDS-PAGE)26-28
• 3.2.3 多肽樣品的制備28-29
• 3.2.4 上機(jī),行液質(zhì)聯(lián)用分析29-30
• 3.2.5 差異蛋白數(shù)據(jù)處理及生物信息學(xué)分析30-31
• 3.3 繪制內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線31
• 3.4 不同濃度的ephrin-B2/Fc對(duì)HUVECs增殖的影響31-32
• 3.5 Ephrin-B2/Fc對(duì)HUVECs細(xì)胞周期的影響32
• 3.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)32-33
• 3.7 Transwell實(shí)驗(yàn)33
• 3.8 Western Blot分析33-37
• 3.8.1 細(xì)胞預(yù)處理33
• 3.8.2 蛋白提取及濃度測(cè)定33-35
• 3.8.3 變性SDS聚丙烯酰胺電泳35-36
• 3.8.4 轉(zhuǎn)膜、封閉、雜交和顯影36-37
• 3.8.5 操作過程中注意事項(xiàng)37
• 3.8.6 數(shù)據(jù)處理37
• 3.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析37-38
• 第四章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果38-71
• 4.1 成功提取人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞38-39
• 4.1.1 形態(tài)學(xué)觀察38
• 4.1.2 免疫組織化學(xué)鑒定結(jié)果38-39
• 4.2 質(zhì)譜檢測(cè)ephrin-B2/Fc處理后HUVECs蛋白差異性表達(dá)39-63
• 4.2.1 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定39-40
• 4.2.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白40
• 4.2.3 生物信息學(xué)分析40-63
• 4.3 內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線63
• 4.4 Ephrin-B2/Fc促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖63-65
• 4.5 Ephrin-B2/Fc對(duì)HUVECs細(xì)胞周期的影響65-66
• 4.6 Ephrin-B2/Fc促進(jìn)HUECs的遷移66-68
• 4.7 Western Blot檢測(cè)增殖遷移相關(guān)蛋白表達(dá)變化68-71
• 第五章 討論71-79
• 5.1 Ephrin-B2在血管生成過程中發(fā)揮重要的作用71-73
• 5.2 差異蛋白的生物信息學(xué)分析73-77
• 5.2.1 Ephrin-B2主要參與內(nèi)皮細(xì)胞的存活、增殖和遷移等生物功能73-74
• 5.2.2 Ephrin-B2可能通過Axonal Guidance Signaling/(ActinCytoskeleton Signaling)Signaling by Rho Family GTPases導(dǎo)引內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移的方向74-75
• 5.2.3 肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Actin Cytoskeleton Signaling)與血管生成關(guān)系密切75-76
• 5.2.4 Ephrin-B2可能通過PI3k-Akt|ZYX|ACIN發(fā)揮抗凋亡效應(yīng)76-77
• 5.3 Ephrin-B2上調(diào)增殖存活相關(guān)蛋白的表達(dá)77
• 5.4 研究的局限性77-79
• 第六章 結(jié)論和展望79-81
• 參考文獻(xiàn)81-92
• 英文縮略詞表92-93
• 致謝93-95
• 附錄95-114

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 譚琳,康由發(fā),施江,鄭學(xué)勤;山蛭基因組DNA的提取及其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析[J];生物技術(shù);2003年03期

  本文關(guān)鍵詞：Ephrin-B2對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響及其蛋白質(zhì)組學(xué)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：392965