本文關(guān)鍵詞：3種呼吸道病毒基因芯片檢測方法的建立與研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：急性呼吸道感染(Acute Respiratory Tract Infection, ARTI)是人類最常見的一種感染性疾病，是危害兒童健康的主要因素之一。臨床表明，絕大多數(shù)急性呼吸道感染是由呼吸道病毒引起，其中鼻病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒是引起病毒性呼吸道感染較常見的病原體。 鼻病毒（Rhinovirus）屬小RNA病毒科，是引發(fā)普通感冒最主要病原體。呼吸道合胞病毒(RSV)為單股負(fù)鏈RNA病毒，屬副粘病毒科（Paramyxoviridae）肺炎病毒屬（Pneumovirus）成員，是引起嬰幼兒急性下呼吸道感染主要病原體。在我國，一些流行性肺炎與該病原有關(guān)。腺病毒(Adenovirus)屬于雙鏈DNA病毒，，可長期存在于人群中，造成急性發(fā)熱性呼吸道感染的大規(guī)模流行。 目前檢測呼吸道病毒的方法有很多種，常用的方法有病毒分離培養(yǎng)法，直接或間接免疫熒光法（IFA/DFA），酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），多重實(shí)時(shí)PCR，巢式PCR，核酸雜交及懸浮陣列技術(shù)等。這些傳統(tǒng)的檢測方法雖有各具優(yōu)勢，但大多存在耗時(shí)長、成本高、檢測通量低、特異性和靈敏性低等問題。因此，建立一種快速準(zhǔn)確檢測呼吸道病毒的方法尤為重要�；蛐酒夹g(shù)因其固有的高通量化、微量化及快速簡便的特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于病毒快速有效的篩查和診斷，具有傳統(tǒng)病毒檢測技術(shù)無法比擬的優(yōu)勢。 本研究目的在于建立一種對鼻病毒、呼吸道合胞病毒以及腺病毒快速檢測的基因芯片方法，并對其進(jìn)行初步驗(yàn)證和評估： 1、引物和探針設(shè)計(jì) 從GenBank下載鼻病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒基因序列，應(yīng)用DNASTAR中MegAlign程序進(jìn)行多基因序列比對，在合成序列使用生物學(xué)軟件Primer5.0和Array Designer4.20完成每種病毒引物及探針的設(shè)計(jì)。每種病毒設(shè)計(jì)多條探針可以彌補(bǔ)個(gè)別探針的交叉反應(yīng)，進(jìn)而提高待檢病毒特異性。 2、檢測基因芯片制備及初步驗(yàn)證 用巢式PCR引物擴(kuò)增標(biāo)記3種病毒的目的基因，然后與固定于光學(xué)級醛基玻片上的探針進(jìn)行雜交、洗滌，最后用芯片掃描儀進(jìn)行掃描分析。在初步驗(yàn)證正確的基礎(chǔ)上，分別對芯片洗液的配方、雜交液甲酰胺的濃度、雜交時(shí)間和溫度進(jìn)行了條件優(yōu)化：選擇自配的芯片洗液，含10%甲酰胺的雜交液，雜交溫度和時(shí)間分別設(shè)置為42℃和3-6h進(jìn)行雜交，雜交效果最佳。 3、檢測基因芯片評估性試驗(yàn) 特異性試驗(yàn)：選取本實(shí)驗(yàn)室保存的副流感病毒和柯薩奇病毒陽性質(zhì)粒、禽流感病毒和新城疫病毒（cDNA）作為檢測對象驗(yàn)證構(gòu)建芯片的特異性； 靈敏性試驗(yàn)：以倍比稀釋的鼻病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒陽性質(zhì)粒為檢測對象評估構(gòu)建基因芯片的靈敏度； 重復(fù)性試驗(yàn)：以鼻病毒、呼吸道合胞病毒以及腺病毒陽性質(zhì)粒為檢測對象，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，片間和片內(nèi)均重復(fù)檢測5次； 保存期試驗(yàn)：本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了為期200天的保存期檢測，確定芯片的最佳儲存時(shí)間和溫度； 本研究成功建立一種檢測鼻病毒、呼吸道合胞病毒以及腺病毒基因芯片的方法。該方法具有良好的特異性和重復(fù)性；可檢測病毒最低拷貝數(shù)依次是鼻病毒2.59×102個(gè)/μL、呼吸道合胞病毒2.21×101個(gè)/μL、腺病毒2.05×102個(gè)/μL，其靈敏度比本實(shí)驗(yàn)已建立的RT-nPCR方法提高10倍；該方法制備的芯片置于-20℃有效期約為160天�；谝陨蟽�(yōu)勢，該方法可作為實(shí)驗(yàn)室檢測3種病毒備選的分子技術(shù)，為臨床提供診斷依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：基因芯片 鼻病毒 呼吸道合胞病毒 腺病毒 檢測
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R373.1;Q78
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 前言12-13
• 第一篇 文獻(xiàn)綜述13-35
• 第一章 急性呼吸道感染概述13-17
• 1.1 急性呼吸道感染的常見病原體13-14
• 1.2 急性病毒性呼吸道感染的流行特點(diǎn)14-15
• 1.3 急性呼吸道感染的危害15-17
• 第二章 呼吸道病毒的研究進(jìn)展17-22
• 2.1 呼吸道病毒的感染特點(diǎn)17-18
• 2.2 呼吸道病毒常用檢測技術(shù)18-22
• 第三章 RHV、RSV 和 ADV 概述22-27
• 3.1 鼻病毒概述22-23
• 3.2 呼吸道合胞病毒概述23-25
• 3.3 腺病毒概述25-27
• 第四章 基因芯片研究進(jìn)展27-35
• 4.1 基因芯片技術(shù)的基本步驟27-29
• 4.2 基因芯片的種類29-30
• 4.3 基因芯片的應(yīng)用30-35
• 第二篇 研究內(nèi)容35-69
• 第一章 RHV、RSV 和 ADV 序列分析與芯片探針設(shè)計(jì)35-48
• 1 材料35-36
• 2 方法36-39
• 3 結(jié)果39-46
• 4 討論46-47
• 5 小結(jié)47-48
• 第二章 RHV、RSV 和 ADV 檢測基因芯片制備及初步驗(yàn)證48-61
• 1 材料49-50
• 2 方法50-53
• 3 結(jié)果53-58
• 4 討論58-60
• 5 小結(jié)60-61
• 第三章 基因芯片評估試驗(yàn)61-69
• 1 材料61
• 2 方法61-63
• 3 結(jié)果63-66
• 4 討論66-67
• 5 小結(jié)67-69
• 結(jié)論69-70
• 參考文獻(xiàn)70-78
• 導(dǎo)師簡介78-79
• 個(gè)人簡介79-80
• 致謝80-81

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前8條

1 黃秋琳;許翔;江淑芳;;直接免疫熒光法對多種呼吸道病毒檢測的臨床意義[J];檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床;2008年03期

2 趙林清 ,錢淵,王之j,朱汝南,鄧潔;呼吸道合胞病毒檢測方法比較[J];臨床兒科雜志;2003年01期

3 丁楙珍,蘇犁云,孫家娥,徐錦;2000～2002年上海地區(qū)小兒呼吸道病毒感染病原學(xué)研究[J];臨床兒科雜志;2004年04期

4 湯洪偉;黃吉城;何劍峰;李暉;梁文佳;鄧愛萍;李靈輝;方艷;方苓;代吉亞;羅會明;林錦炎;;廣東省野生動物接觸人群SARS冠狀病毒感染危險(xiǎn)因素分析[J];中國熱帶醫(yī)學(xué);2006年07期

5 黃堅(jiān),杜清友,丁雨,王升啟;腫瘤相關(guān)基因表達(dá)檢測寡核苷酸芯片的制備及其初步應(yīng)用[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2003年06期

6 竇蓉,孫晨光;基因芯片技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用和發(fā)展[J];現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2004年01期

7 申昆玲,買潁,劉亞誼,江載芳,照日格圖;用免疫熒光方法檢測鼻咽分泌物中多種呼吸道病毒抗原[J];中華兒科雜志;1999年07期

8 林嘉穎,楊學(xué)寧,楊矜記,廖日強(qiáng),吳一龍;基因芯片篩選同時(shí)參與肺腺癌不同癌變進(jìn)程的分子靶標(biāo)[J];腫瘤研究與臨床;2005年03期

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 席進(jìn);狂犬病病毒屬7種主要病毒檢測芯片的研制[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2012年

  本文關(guān)鍵詞：3種呼吸道病毒基因芯片檢測方法的建立與研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：392624