本文包括兩個部分：(1)人丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)E1基因的表達及E1蛋白質免疫學性質研究。(2)人巨細胞病毒(Human Cytomegalovirus，HCMV)最早期蛋白與轉錄調控蛋白相互作用研究。 本文首次報道了HCV武漢株(WH strain)全長E1基因cDNA全序列，將該cDNA分別克隆于載體pQE30、pBlueBacHisB和pcDNA3.1(-)中，分別在大腸桿菌、真核細胞和實驗動物肌肉組織中進行表達。全面研究了HCV E1 cDNA在大腸桿菌和真核細胞中表達的HCV E1蛋白的抗原性和免疫原性。該研究有助于進一步了解HCV包膜蛋白的功能和揭示HCV E1的變異規(guī)律及其特點，為將E1蛋白質應用于HCV的臨床診斷和研制有效的、HCV疫苗，預防和治療丙型肝炎提供了重要的參考和依據。 HCV全長E1 cDNA含576bp，編碼含192個氨基酸的蛋白質。HCV武漢株和日本株(HCV-J型)E1基因核苷酸的同源性為74.48％，編碼的氨基酸的同源性為78.13％。其免疫優(yōu)勢表位P1(210-223aa)和P2(315-327a...

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【學位級別】：博士

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第一部分 人丙型肝炎病毒E1基因的表達及E1蛋白質免疫學性質研究
    Ⅰ 文獻綜述
        1.1 人丙型肝炎病毒顆粒的特征
            1.1.1 病毒顆粒的形態(tài)
            1.1.2 病毒顆粒的密度
            1.1.3 體外感染細胞內病毒顆粒
        1.2 人丙型肝炎病毒的分子生物學
            1.2.1 HCV基因組結構及序列的多樣性
            1.2.2 HCV蛋白質的加工及病毒蛋白的性質和功能
        1.3 HCV的變異和分型
            1.3.1 HCV的變異
            1.3.2 HCV基因型
            1.3.3 HCV基因型分布
            1.3.4 其它
        1.4 人丙型肝炎病毒的致病性
            1.4.1 急性感染
            1.4.2 慢性感染
            1.4.3 HCV與肝細胞癌
        1.5 HCV的流行病學和臨床診斷
            1.5.1 HCV的流行病學
            1.5.2 HCV的臨床診斷
        1.6 人丙型肝炎病毒的疫苗
            1.6.1 HCV感染后的免疫應答
            1.6.2 HCV疫苗
        1.7 HCV包膜蛋白的研究進展
            1.7.1 包膜蛋白區(qū)的基因結構
            1.7.2 包膜蛋白區(qū)高變區(qū)
            1.7.3 包膜蛋白的表達
            1.7.4 包膜蛋白的結構和功能
            1.7.5 包膜蛋白的免疫與疫苗研究進展
    Ⅱ 研究目的
    Ⅲ HCV E1基因的克隆和序列分析
        3.1 材料與方法
            3.1.1 材料
            3.1.2 方法
        3.2 結果與分析
            3.2.1 HCV E1基因的PCR擴增
            3.2.2 HCV E1基因的克隆和鑒定
            3.2.3 含HCV E1基因表達質粒的構建和鑒定
            3.2.4 HCV E1基因序列測定和分析
            3.2.5 武漢株(WH strain)和日本株(HCV-J型)E1基因DNA和編碼氨基酸序列比較
        3.3 討論
            3.3.1 HCV E1基因在HCV分型中的作用
            3.3.2 HCV E1蛋白半胱氨酸殘基與E1E2復合體
            3.3.3 HCV E1蛋白糖基化位點
            3.3.4 HCV E1蛋白抗原表位結構位點分析
        3.4 小結
    Ⅳ HCV E1基因在大腸桿菌中的表達及E1蛋白質免疫學性質的研究
        4.1 材料與方法
            4.1.1 材料
            4.1.2 方法
        4.2 結果與分析
            4.2.1 HCV E1基因在大腸桿菌中的表達
            4.2.2 HCV E1蛋白的純化
            4.2.3 HCV E1包涵體的電鏡觀察
            4.2.4 HCV E1蛋白的抗原性分析
            4.2.5 小鼠抗HCV E1 IgG的檢測
            4.2.6 家兔抗HCV E1 IgG的檢測
            4.2.7 小鼠抗HCV E1 IgA的檢測
            4.2.8 小鼠抗HCV E1 SIgG的檢測
            4.2.9 小鼠抗HCV E1 sIgA的檢測
            4.2.10 CTL效應的檢測
            4.2.11 小鼠CD4
-、CD8
-細胞數量的變化
            4.2.12 遲發(fā)型超敏反應(DTH)結果
            4.2.13 安全性
        4.3 討論
            4.3.1 HCV E1蛋白抗原性
            4.3.2 HCV E1蛋白誘生特異性體液免疫應答
            4.3.3 HCV E1蛋白誘導小鼠粘膜產生免疫應答
            4.3.4 HCV E1蛋白誘生特異性細胞免疫應答
            4.3.5 HCV E1基因在大腸桿菌中的表達和包涵體蛋白的形成
            4.3.6 HCV E1蛋白糖基化及其免疫學性質的關系
        4.4 小結
    Ⅴ HCV E1在昆蟲細胞中的表達及E1蛋白質免疫學性質的研究
        5.1 材料與方法
            5.1.1 材料
            5.1.2 方法
        5.2 結果與分析
            5.2.1 重組轉移質粒的構建
            5.2.2 重組病毒的篩選與鑒定
            5.2.3 HCV E1基因在昆蟲細胞中的表達
            5.2.4 HCV E1蛋白的純化
            5.2.5 HCV E1蛋白的抗原性分析
            5.2.6 昆蟲細胞和大腸桿菌表達的HCV E1蛋白抗原性比較
            5.2.7 小鼠抗HCV E1 IgG的檢測
            5.2.8 家兔抗HCV E1 IgG的檢測
            5.2.9 小鼠抗HCV E1 IgA的檢測
            5.2.10 小鼠抗HCV E1 sIgG的檢測
            5.2.11 小鼠抗HCV E1 sIgA的檢測
            5.2.12 CTL效應的檢測
            5.2.13 小鼠CD4
-、CD8
-細胞數量的變化
            5.2.14 遲發(fā)型超敏反應(DTH)結果
            5.2.15 安全性
        5.3 討論
            5.3.1 HCV E1基因在昆蟲細胞中的表達
            5.3.2 HCV E1蛋白的純化
            5.3.3 HCV E1蛋白的抗原性
            5.3.4 HCV E1蛋白誘生特異性體液免疫應答
            5.3.5 HCV E1蛋白誘導小鼠粘膜產生免疫應答
            5.3.6 HCV E1蛋白誘生特異性細胞免疫應答
        5.4 小結
    Ⅵ HCV E1基因在真核細胞中的表達和DNA免疫
        6.1 材料與方法
            6.1.1 材料
            6.1.2 方法
        6.2 結果與分析
            6.2.1 含HCV E1基因真核表達質粒的構建和鑒定
            6.2.2 HCV E1基因在真核細胞中的表達
            6.2.3 HCV E1基因在小鼠肌肉組織中的原位表達
            6.2.4 小鼠抗HCV E1 IgG的檢測
            6.2.5 兔抗HCV E1 IgG的檢測
            6.2.6 體外CTL檢測
            6.2.7 CD4
-、CD8
-細胞數量的變化
            6.2.8 安全性
        6.3 討論
            6.3.1 HCV DNA免疫
            6.3.2 HCV E1基因在HepG2細胞中的表達
            6.3.3 HCV E1基因在肌肉組織中的原位表達
            6.3.4 pcE1誘生的特異性體液免疫應答
            6.3.5 pcE1誘生的特異性細胞免疫應答
            6.3.6 提高HCV DNA免疫效果的途徑
            6.3.7 HCV DNA疫苗的安全性
        6.4 小結
    Ⅶ 總結
第二部分 人巨細胞病毒最早期蛋白與轉錄調控蛋白相互作用研究
    Ⅰ 文獻綜述
        1.1 人巨細胞病毒的致病性
        1.2 人巨細胞病毒顆粒的特征
        1.3 人巨細胞病毒基因組結構
        1.4 人巨細胞病毒基因表達產物
            1.4.1 HCMV的結構蛋白
            1.4.2 HCMV的非結構蛋白
        1.5 人巨細胞病毒立即早期基因
            1.5.1 HCMV基因的時序性表達
            1.5.2 HCMV IE基因的增強子
        1.6 人巨細胞病毒立即早期蛋白功能
            1.6.1 IE72蛋白的功能
            1.6.2 IE86蛋白的功能
            1.6.3 IE55蛋白的功能
    Ⅱ 研究目的
    Ⅲ 含HCMV IE86 cDNA重組質粒的構建
        3.1 材料與方法
            3.1.1 材料
            3.1.2 方法
        3.2 結果與分析
            3.2.1 重組質粒pBIE86的構建和鑒定
            3.2.2 重組質粒pGIE86的構建和鑒定
        3.3 討論
            3.3.1 HCMV IE86基因
            3.3.2 重組質粒pBIE86
            3.3.3 重組質粒pGIE86
        3.4 小結
    Ⅳ HCMV IE86基因在大腸桿菌中的表達及GST-IE86融合蛋白的純化
        4.1 材料與方法
            4.1.1 材料
            4.1.2 方法
        4.2 結果與分析
            4.2.1 HCMV IE86基因在大腸桿菌中的表達
            4.2.2 GST-IE86融合蛋白的純化
        4.3 討論
            4.3.1 可溶性GST-IE86融合蛋白
            4.3.2 GST-IE86融合蛋白的純化
            4.3.3 HCMV IE86在昆蟲細胞中的表達
        4.4 小結
    Ⅴ HCMV IE86蛋白與通用轉錄因子和轉錄調控因子相互作用的研究
        5.1 材料與方法
            5.1.1 材料
            5.1.2 方法
        5.2 結果與分析
            5.2.1 IE86蛋白與通用轉錄因子TFⅡB的相互作用
            5.2.2 IE86蛋白與轉錄調控因子SP1的相互作用
            5.2.3 IE86蛋白與轉錄調控因子AP1的相互作用
            5.2.4 IE86蛋白與轉錄調控因子AP2的相互作用
            5.2.5 IE86蛋白與轉錄調控因子NF-κB的相互作用
        5.3 討論
            5.3.1 HCMV IE86蛋白的功能
            5.3.2 轉錄因子
            5.3.3 HCMV IE86蛋白與TFⅡB的相互作用
            5.3.4 HCMV IE86蛋白與SP1的相互作用
            5.3.5 HCMV IE86蛋白與AP1的相互作用
            5.3.6 HCMV IE86蛋白與AP2的相互作用
            5.3.7 HCMV IE86蛋白與NF-κB的相互作用
            5.3.8 HCMV IE86蛋白激活基因轉錄機制
        5.4 小結
    Ⅵ 總結
附圖
參考文獻
在學期間發(fā)表的論文
致謝



本文編號：3924151

boshi