本文關鍵詞：低密度瘧原蟲血癥檢測方法的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的本研究針對我國消除瘧疾階段流行程度較低,存在一定比例的低原蟲密度的瘧疾病例,以至鏡檢難以發(fā)現(xiàn)潛在傳染源這一主要問題,圍繞低密度瘧原蟲血癥的定量界定、實驗室檢測技術的比較以及現(xiàn)場樣本的檢測,通過對以PCR為基礎的三種分子生物學檢測方法進行實驗室和現(xiàn)場檢測比較研究,以探討適合低密度瘧原蟲血癥患者的較為靈敏檢測方法,在此基礎上了解瘧疾癥狀人群中低密度瘧原蟲血癥患者的程度和比例,為我國消除瘧疾傳染源發(fā)現(xiàn)與管理以及診斷參比實驗室網(wǎng)絡建設充實技術方法與理論依據(jù),具有一定的理論價值和現(xiàn)實意義。 方法研究分兩大部分,分別為：低密度瘧原蟲血癥實驗室檢測方法比較和低密度瘧原蟲血癥現(xiàn)場檢測與驗證。第一部分采用惡性瘧原蟲(FCCI/HN)體外培養(yǎng)及同步化、顯微鏡及三種常用分子生物學技術,對實驗室培養(yǎng)的同步化的惡性瘧原蟲血和現(xiàn)場采集的間日瘧原蟲血進行了稀釋和梯度檢測,以鏡檢技術無法檢出的稀釋梯度上的原蟲密度為臨界值界定低密度瘧原蟲血癥。對上述低密度惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲血樣進一步梯度稀釋,采用多重PCR、巢式PCR、實時PCR三種分子生物學方法對不同稀釋梯度的血樣逐一檢測,比較不同方法的檢測限及檢出率。第二部分在實驗室研究的基礎上運用三種PCR方法同時對現(xiàn)場采集的147份鏡檢陰性但具有發(fā)熱癥狀的瘧疾疑似病例樣本進行檢測,以進一步現(xiàn)場驗證三種方法的檢測敏感性,并評價研究現(xiàn)場低密度瘧原蟲血癥的比例。(1)通過實驗室培養(yǎng)及同步化處理獲取一定濃度的環(huán)狀體期占99%以上的惡性瘧原蟲血1份,通過現(xiàn)場采集的方式獲取間日瘧原蟲外周血樣本1份,并分別涂制血膜,其中厚血膜用血量約4～4.5μl,薄血膜用血量1～1.5μl,利用吉氏染色法進行染色,由2名有經(jīng)驗的瘧原蟲鏡檢專家(經(jīng)WHO認證Ⅲ級以上專家)進行顯微鏡檢測并計數(shù)原蟲密度,其中對來自實驗室培養(yǎng)的惡性瘧原蟲血按紅細胞數(shù)為4.5×106個/μl血采用薄血膜計數(shù)法進行計數(shù)；對來自現(xiàn)場的間日瘧原蟲血樣本則采用白細胞計數(shù)法計數(shù)原蟲密度,其中白細胞的計數(shù)以實際計數(shù)為準(本樣本為3.2×103個白細胞/μl血)。(2)利用健康O型血對上述濃度已知的間日瘧原蟲血樣和惡性瘧原蟲血樣按照1：40、1：80、1：160、......1：40960等11個濃度梯度進行倍比稀釋,每一濃度分三組每組3張血片進行涂片鏡檢,由2名有經(jīng)驗的瘧原蟲鏡檢專家進行檢測,確定每一濃度所有血的顯微鏡檢測結果,整張厚血膜未發(fā)現(xiàn)瘧原蟲者記為陰性。當某一濃度3張血片都為陰性時,該濃度的上一濃度即為低密度瘧原蟲血癥的臨界濃度(即顯微鏡檢測限)本研究將濃度低于該值的瘧原蟲血樣定為低密度瘧原蟲血樣；(3)對顯微鏡檢測確定的低密度瘧原蟲血樣按照(1：2、1：22、1：23、1：24、1：25......)進行倍比稀釋并利QIAamp DNA mini kit提取DNA,同時利用三種常用的分子生物學方法(多重PCR、巢式PCR、實時PCR)對每一濃度梯度樣本進行檢測,并對三者的檢測限和不同濃度的檢出率進行統(tǒng)計學分析,檢測限低、各濃度檢出率高的檢測方法即為本研究的適合低密度瘧原蟲血癥檢測的方法；(4)利用QIAamp DNA mini kit提取現(xiàn)場采集的147份具有發(fā)熱癥狀但通過顯微鏡檢測結果為陰性的瘧疾疑似病例的濾紙血樣本DNA,并同時利用上述三種分子生物學方法進行檢測,統(tǒng)計各種分子生物學方法的檢出率,利用χ2檢驗對三種方法的檢測率進行比較分析,從而對三種方法進行現(xiàn)場檢測和驗證。 結果(1)對于惡性瘧原蟲：顯微鏡檢測的臨界值為21.92個蟲/μl血,多重PCR、巢式PCR和實時PCR的檢測限分別為0.1713個蟲/μl血、0.0856個蟲/μl血、0.1713個蟲/μl血。當原蟲密度為0.1713個蟲/μl血時,三種方法檢出率分別為66.7%(6/9)、100%(9/9)、100%(9/9),差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)；當原蟲密度為0.0856個蟲/μl血時,三種方法檢出率分別為0%(0/9)、66.7%(6/9)、55.6%(5/9),差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)；當原蟲密度為0.0428個蟲/μl血時,三種方法檢出率分別為0%(0/9)、33.3%(3/9)、44.4%(4/9),差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)；當原蟲密度為0.0214個蟲/μl血時,三種方法檢出率分別為0%(0/9)、11.1%(1/9)、11.1%(1/9),差異不具有統(tǒng)計學意義(P0.05)；當原蟲密度為0.0107個蟲/μl血時,三種方法均未能檢出,檢出率均為0%(0/9)。(2)對于間日瘧原蟲：顯微鏡檢測的臨界值為11.06個蟲/μl血,多重PCR、巢式PCR和實時PCR的檢測限分別為0.3455個蟲/μl血、0.0864個蟲/μl血和0.3455個蟲/μl血。當原蟲密度為0.1728個蟲/μl血時,三種方法檢出率分別為0%(0/9)、100%(9/9)、11.1%(1/9),差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)；當原蟲密度為0.0864個蟲/μ1血時,三種方法檢出率分別為11.1%(1/9)、77.8%(7/9)、100%(9/9),差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)；當原蟲密度為0.0432個蟲/μl血時,三種方法檢出率分別為0%(0/9)、66.7%(6/9)、0%(0/9),差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)；當原蟲密度為0.0216個蟲/μl血時,三種方法檢出率分別為0%(0/9)、11.1%(1/9)、0%(0/9),差異不具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(3)對現(xiàn)場采集的147份鏡檢陰性的瘧疾疑似病例血樣中,三種方法分別檢出陽性：3例、13例、8例。檢出率分別為2.0%(3/147)、8.8%(13/147)、5.4%(8/147),差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。巢式PCR檢測結果顯示低密度瘧原蟲血癥患者在顯微鏡鏡檢陰性的瘧疾疑似病例中所占比例為8.8%(13/147),由此推斷我國云南省騰沖縣低密度瘧原蟲血癥患者的比例約為：8.8%,95%CI為(4.2%,13.4%)。 結論結果表明：鏡檢技術對惡性瘧原蟲的檢測限為21.96個蟲/μl血,間日瘧原蟲為11.05個蟲/μl血,以此臨界值界定低密度瘧原蟲血癥。三種PCR檢測技術均能一定程度地檢測低密度瘧原蟲血癥血樣,其中巢式PCR方法檢測限最低(對惡性瘧原蟲血達0.0856個蟲/μl血,對間日瘧原蟲達0.0864個蟲/μl血),不同濃度下,檢出率較多重PCR和實時PCR高。其靈敏度明顯高于其它兩種方法�，F(xiàn)場采集的147份鏡檢陰性但具發(fā)熱癥狀(設定為低密度瘧原蟲血癥患者)血樣檢測結果也顯示巢式PCR的檢出率最高,檢出13例,表明研究現(xiàn)場低密度瘧原蟲血癥患者高達8.8%(4.2%,13.4%)。
【關鍵詞】：低密度瘧原蟲血癥 PCR方法 檢測限 檢出率
【學位授予單位】：中國疾病預防控制中心
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R531.3;R3416
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• Abstract8-11
• 前言11-17
• 研究背景及據(jù)11-15
• 研究目的15
• 研究內容15-16
• 技術路線16-17
• 第一部分 低密度瘧原蟲血癥實驗室檢測方法的比較17-41
• 前言17
• 材料和方法17-28
• 結果28-38
• 討論38-41
• 第二部分 低密度瘧原蟲血癥現(xiàn)場檢測與驗證41-45
• 前言41
• 材料與方法41-43
• 結果43
• 討論43-45
• 全文小結45-47
• 參考文獻47-52
• 附錄52-70
• 致謝70

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

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  本文關鍵詞：低密度瘧原蟲血癥檢測方法的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：391937