背景和目的：近年來(lái)，大量細(xì)胞學(xué)和病毒學(xué)研究報(bào)道證實(shí)多種疾病與人乳頭瘤病毒(HPV)感染密切相關(guān)。在應(yīng)用免疫抑制劑的病人或免疫低下的患者，HPV感染機(jī)率增高，且有些患者皮損可自行消退(疣，癌前期病變)，提示免疫系統(tǒng)在HPV感染性疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用。免疫干預(yù)治療將成為HPV治療的重要手段，DNA疫苗為治療各種HPV相關(guān)感染和腫瘤提供了有力武器，E6、E7蛋白是HPV16治療性疫苗重要靶抗原。然而DNA疫苗的安全性和免疫效率低是困擾其臨床廣泛應(yīng)用的最大障礙。本研究從基因突變和與單純皰疹病毒(HSV-1)VP22基因融合2個(gè)角度構(gòu)建2種DNA疫苗，并對(duì)其免疫原性進(jìn)行評(píng)價(jià)。 方法：(1) 載體構(gòu)建：采用PCR方法突變HPV16E7鋅指結(jié)合區(qū)第58和91位氨基酸。設(shè)計(jì)含有突變位點(diǎn)的2對(duì)引物，采用4次PCR，擴(kuò)增出含有2個(gè)突變位點(diǎn)的片斷，將原序列中CYS(半胱氨酸)突變?yōu)镚LY(甘氨酸)，插入到真核表達(dá)載體pcDNA3.1，構(gòu)建突變型表達(dá)載體pcDNA-16ME7。同時(shí)將野生型E7片斷插入pcDNA3.1，構(gòu)建pcDNA-16E7，作為對(duì)照。另外，PCR擴(kuò)增VP22序列，插入pc...

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

圖1一4.PCR擴(kuò)增HPV16E7l.pBR322/Hinflmarke:l.HPV16陽(yáng)性宮頸癌組織標(biāo)本

PCR擴(kuò)增HPV16E7設(shè)計(jì)含有BamHI和EocRI酶切位點(diǎn)的擴(kuò)增全長(zhǎng)HPV16E7的引物，擴(kuò)增出全長(zhǎng)基因，與預(yù)期結(jié)果相同，擴(kuò)增長(zhǎng)度約300Pb(圖1一4)。3.PeR擴(kuò)增突變后E7(ME7)按照材料與方法所述，設(shè)計(jì)含有HPV16E7第58和91位氨基酸突變位點(diǎn)的引物，經(jīng)4次P....

圖1一5.載體酶切鑒定圖1一7.PCR擴(kuò)增VP22片斷

.DNAMarker(DL2000+DL15OO)圖1一7.PCR擴(kuò)增VP22片斷1.PBR322H/inflmarker2.VP22片斷3.陰性對(duì)照5.PcDNA一16ME7序列分析:為了證實(shí)突變后序列含有預(yù)期的突變位點(diǎn)，采用pUC顧13正向和反向測(cè)序引物進(jìn)行雙向測(cè)序，結(jié)果如圖....

圖2一1.pcA一VP22/E7轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞圖2一.2PcDNA一E7轉(zhuǎn)染細(xì)胞，胞核

COS一7細(xì)胞，在24和4h8時(shí)進(jìn)行免疫熒光染色，結(jié)果在24h時(shí)PcDNA一16E7、PcDNA一16ME7、PcDNA一E7戊P22均見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞，前兩者著色部位在細(xì)胞核，而在pQDNA一E7鄺p22轉(zhuǎn)染后細(xì)胞漿亦可見(jiàn)著色(圖2一1)。在48h時(shí)，pcDNA一16ME7陽(yáng)性細(xì)胞消....

圖2一4.12%SDS聚丙烯酞胺凝膠電泳和wesetmblot分析

‘卜國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院博卜生畢業(yè)論文圖2一3.pcDNA一16ME7轉(zhuǎn)染后細(xì)胞核裂解kDa97664320l4圖2一4.12%SDS聚丙烯酞胺凝膠電泳和wesetmblot分析(1:低分子量蛋白質(zhì)PeDNA一ME7，PeDNA一3.marker，2，3，4，5分別為peDNA一Vp22....

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