本文關鍵詞：人類博卡病毒非結構蛋白NS1、NP1重組桿狀病毒的制備及NP1核定位信號的初探，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：2005年,瑞典科學家Tobias Allander等利用隨機PCR、高通量測序和生物信息學的方法在下呼吸道被感染的嬰幼兒標本中發(fā)現(xiàn)一種新病毒,根據序列同源性將其命名為人類博卡病毒(Human Bocavirus, HBoV)。人類博卡病毒是一種二十面體對稱的細小病毒,直徑18-25nm,無囊膜,基因組以單鏈線性方式存在,大小約為5500bp。根據目前的分類系統(tǒng),人類博卡病毒隸屬于博卡病毒屬,細小病毒亞科,細小病毒科。人類博卡病毒的基因組主要有三個開放閱讀框,按5’到3’方向依次編碼非結構蛋白NS1、非結構蛋白NP1以及由重疊基因編碼的結構蛋白VPl和VP2。病毒感染細胞時,非結構蛋白NS1最先被轉錄和翻譯,病毒基因組的復制和表達需要NS1蛋白的調控。另一個非結構蛋白NP1作為博卡病毒屬特有的蛋白,功能還不明確,已有的研究表明其對犬細小病毒(MVC)的DNA復制具有重要作用。 本課題根據人類博卡病毒基因組序列(NCBI GeneBank:GU139423)設計多對引物擴增NS1抗原表位(C端1423-2172nt：750bp)、NS1全長、NP1全長基因及NP1截短基因。NP1和NS1全長基因克隆到已成功插入人類博卡病毒啟動子HBoV和EGFP基因的pFastBac1供體質粒上,將測序正確的pFB-BoV-EGFP、 pFB-BoV-EGFP-NS1/NP1重組供體質粒轉化DH10Bac感受態(tài)細胞,72h后通過藍白斑篩選和酚氯仿抽提出正確的重組bacmid并轉染Sf9細胞制備所需的重組桿狀病毒Bac-BoV-EGFP、Bac-BoV-EGFP-NS1/NP1;NS1抗原表位基因插入原核表達載體pMal-c2x上,IPTG誘導及過柱純化MBP融合蛋白,最后免疫小鼠制備抗NS1蛋白的多克隆抗體；利用NetPhos2.0Server軟件分析NP1蛋白中能磷酸化的氨基酸所對應的堿基,設計引物PCR擴增具磷酸化位點和無磷酸化位點的NP1截短基因,克隆到真核表達載體pEGFP-N1后轉染HeLa細胞,48h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光的分布,初步探究NPl蛋白的核定位信號。同時,將NP1截短基因插入另一真核表達載體pCDNA3.1(+)中,為探究NP1蛋白具體功能域做好克隆準備。 Bac-BoV-EGFP、Bac-BoV-EGFP-NS1/NP1重組桿狀病毒、NS1抗體的制備為探究人類博卡病毒非結構蛋白NS1、NPl的功能提供了豐富的科研材料；初步確定的非結構蛋白NP1在HeLa細胞中的核定位情況為以后進一步研究此蛋白的相關功能提供了參考數據。
【關鍵詞】：人類博卡病毒 非結構蛋白 抗體 桿狀病毒 核定位信號
【學位授予單位】：華中師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R373;R3416
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-11
• 第一章 前言11-20
• 1.1 細小病毒的概述11-13
• 1.1.1 細小病毒的形態(tài)結構11
• 1.1.2 細小病毒的分類11-12
• 1.1.3 細小病毒的流行病學12-13
• 1.2 博卡病毒屬的概述13
• 1.3 人類博卡病毒的概述13-15
• 1.3.1 人類博卡病毒的形態(tài)結構13-14
• 1.3.2 人類博卡病毒的亞型14
• 1.3.3 人類博卡病毒的流行病學14-15
• 1.4 桿狀病毒的概述15-16
• 1.5 相關載體的概述16-18
• 1.5.1 pMal-c2x的概述16
• 1.5.2 pEGFP-N1的概述16-17
• 1.5.3 pFastBac1的概述17
• 1.5.4 pcDNA3.1(+)的概述17-18
• 1.6 本課題研究的目的及意義18-20
• 第二章 實驗材料20-24
• 2.1 實驗所需儀器和材料20
• 2.1.1 實驗儀器20
• 2.1.2 菌株、質粒、細胞20
• 2.1.3 主要試劑20
• 2.2 常用培養(yǎng)基和溶液的配制20-24
• 2.2.1 細菌培養(yǎng)基的配制20-21
• 2.2.2 DNA電泳所需溶液的配制21
• 2.2.3 堿裂解法提質粒溶液的配制21
• 2.2.4 SDS-PAGE電泳溶液的配制21-22
• 2.2.5 Western Blot溶液的配制22
• 2.2.6 pMal-c2x蛋白純化溶液的配制22-23
• 2.2.7 各種抗生素的配制23
• 2.2.8 IPTG和X-gal的配制23
• 2.2.9 細胞培養(yǎng)所需溶液的配制23-24
• 第三章 實驗方法24-35
• 3.1 人類博卡病毒非結構蛋白NS1和NP1重組桿狀病毒的制備24-27
• 3.1.1 引物設計和合成24
• 3.1.2 重組供體質粒的構建24-25
• 3.1.2.1 pFB-BoV-EGFP重組質粒的構建24-25
• 3.1.2.2 pFB-BoV-EGFP-NSl/NPl 重組質粒的構建25
• 3.1.3 Bac-BoV-EGFP、Bac-BoV-EGFp-NS1/NP1的制備與鑒定25-27
• 3.1.4 重組桿狀病毒Bac-BoV-EGFP、Bac-BoV-EGFP-NS1/NP1的制備27
• 3.2 人類博卡病毒非結構蛋白NS1抗原表位(C端1423-2172NT：750 BP)多克隆抗體的制備27-30
• 3.2.1 引物的設計和合成27
• 3.2.2 重組質粒的構建及驗證27-28
• 3.2.3 融合蛋白的誘導表達28
• 3.2.4 Western Blot驗證融合蛋白28-29
• 3.2.4.1 SDS-PAGE蛋白電泳分離融合蛋白28
• 3.2.4.2 半干轉膜28-29
• 3.2.4.3 融合蛋白免疫檢測29
• 3.2.5 融合蛋白最佳誘導條件的確定29
• 3.2.6 融合蛋白的大量表達及Amylose親和純化29-30
• 3.2.6.1 融合蛋白的大量表達29
• 3.2.6.2 融合蛋白的純化29-30
• 3.2.7 多克隆抗體的制備30
• 3.3 人類博卡病毒非結構蛋白NP1在HELA細胞中核定位信號的初探30-33
• 3.3.1 引物的設計和合成30-32
• 3.3.2 pEGFP-N1-NP1截短重組質粒的構建32
• 3.3.3 觀察NP1蛋白在HeLa細胞中的熒光分布32-33
• 3.4 PCDNA3.1(+)-NP1截短重組質粒的構建33-35
• 3.4.1 引物設計和合成33-34
• 3.4.2 pcDNA3.1(+)-NP1截短重組質粒的構建34-35
• 第四章 實驗結果35-49
• 4.1 人類博卡病毒非結構蛋白NS1和NP1重組桿狀病毒的構建35-39
• 4.1.1 目的基因的PCR擴增35-36
• 4.1.1.1 HBoV+EGFP基因的PCR擴增35
• 4.1.1.2 NS1/NP1基因的PCR擴增35-36
• 4.1.2 供體質粒的雙切及重組供體質粒的驗證36-37
• 4.1.2.1 pFB-BoV-EGFP重組質粒的雙切處理36
• 4.1.2.2 pFB-BoV-EGFP-NS1/NP1重組供體質粒的驗證36-37
• 4.1.3 Bac-BoV-EGFP、Bac-BoV-EGFP-NS1/NP1重組bacmid驗證37-38
• 4.1.4 重組桿狀病毒Bac-BoV-EGFP、Bac-BoV-EGFP-NS1/NP1的制備38-39
• 4.2 人類博卡病毒非結構蛋白NS1抗原表位(C端1423-2172 NT：750 BP)多克隆抗體的制備39-43
• 4.2.1 PCR擴增目的片段及載體雙切處理39-40
• 4.2.2 重組質粒pMal-c2x-NS1截短的驗證40-41
• 4.2.3 Western Blot驗證融合蛋白41
• 4.2.4 融合蛋白最佳誘導條件的確定41-42
• 4.2.5 融合蛋白的大量表達及純化42-43
• 4.2.6 鑒定多克隆抗體43
• 4.3 人類博卡病毒非結構蛋白NP1在HELA細胞中核定位信號的初探43-47
• 4.3.1 PCR擴增目的片段43-44
• 4.3.2 重組質粒的構建和驗證44-46
• 4.3.3 觀察NP1蛋白在HeLa細胞中的熒光分布46-47
• 4.4 PCDNA3.1(+)-NP1截短重組質粒的構建47-49
• 4.4.1 PCR擴增目的片段47-48
• 4.4.2 pcDNA3.1(+)重組質粒的構建和驗證48-49
• 第五章 討論49-51
• 參考文獻51-56
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術論文56-57
• 致謝57

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