本文關(guān)鍵詞：人類博卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NP1重組桿狀病毒的制備及NP1核定位信號(hào)的初探，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：2005年,瑞典科學(xué)家Tobias Allander等利用隨機(jī)PCR、高通量測(cè)序和生物信息學(xué)的方法在下呼吸道被感染的嬰幼兒標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)一種新病毒,根據(jù)序列同源性將其命名為人類博卡病毒(Human Bocavirus, HBoV)。人類博卡病毒是一種二十面體對(duì)稱的細(xì)小病毒,直徑18-25nm,無(wú)囊膜,基因組以單鏈線性方式存在,大小約為5500bp。根據(jù)目前的分類系統(tǒng),人類博卡病毒隸屬于博卡病毒屬,細(xì)小病毒亞科,細(xì)小病毒科。人類博卡病毒的基因組主要有三個(gè)開(kāi)放閱讀框,按5’到3’方向依次編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、非結(jié)構(gòu)蛋白NP1以及由重疊基因編碼的結(jié)構(gòu)蛋白VPl和VP2。病毒感染細(xì)胞時(shí),非結(jié)構(gòu)蛋白NS1最先被轉(zhuǎn)錄和翻譯,病毒基因組的復(fù)制和表達(dá)需要NS1蛋白的調(diào)控。另一個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白NP1作為博卡病毒屬特有的蛋白,功能還不明確,已有的研究表明其對(duì)犬細(xì)小病毒(MVC)的DNA復(fù)制具有重要作用。 本課題根據(jù)人類博卡病毒基因組序列(NCBI GeneBank:GU139423)設(shè)計(jì)多對(duì)引物擴(kuò)增NS1抗原表位(C端1423-2172nt：750bp)、NS1全長(zhǎng)、NP1全長(zhǎng)基因及NP1截短基因。NP1和NS1全長(zhǎng)基因克隆到已成功插入人類博卡病毒啟動(dòng)子HBoV和EGFP基因的pFastBac1供體質(zhì)粒上,將測(cè)序正確的pFB-BoV-EGFP、 pFB-BoV-EGFP-NS1/NP1重組供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞,72h后通過(guò)藍(lán)白斑篩選和酚氯仿抽提出正確的重組bacmid并轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞制備所需的重組桿狀病毒Bac-BoV-EGFP、Bac-BoV-EGFP-NS1/NP1;NS1抗原表位基因插入原核表達(dá)載體pMal-c2x上,IPTG誘導(dǎo)及過(guò)柱純化MBP融合蛋白,最后免疫小鼠制備抗NS1蛋白的多克隆抗體；利用NetPhos2.0Server軟件分析NP1蛋白中能磷酸化的氨基酸所對(duì)應(yīng)的堿基,設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增具磷酸化位點(diǎn)和無(wú)磷酸化位點(diǎn)的NP1截短基因,克隆到真核表達(dá)載體pEGFP-N1后轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,48h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光的分布,初步探究NPl蛋白的核定位信號(hào)。同時(shí),將NP1截短基因插入另一真核表達(dá)載體pCDNA3.1(+)中,為探究NP1蛋白具體功能域做好克隆準(zhǔn)備。 Bac-BoV-EGFP、Bac-BoV-EGFP-NS1/NP1重組桿狀病毒、NS1抗體的制備為探究人類博卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NPl的功能提供了豐富的科研材料；初步確定的非結(jié)構(gòu)蛋白NP1在HeLa細(xì)胞中的核定位情況為以后進(jìn)一步研究此蛋白的相關(guān)功能提供了參考數(shù)據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：人類博卡病毒 非結(jié)構(gòu)蛋白 抗體 桿狀病毒 核定位信號(hào)
【學(xué)位授予單位】：華中師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R373;R3416
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-11
• 第一章 前言11-20
• 1.1 細(xì)小病毒的概述11-13
• 1.1.1 細(xì)小病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)11
• 1.1.2 細(xì)小病毒的分類11-12
• 1.1.3 細(xì)小病毒的流行病學(xué)12-13
• 1.2 博卡病毒屬的概述13
• 1.3 人類博卡病毒的概述13-15
• 1.3.1 人類博卡病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)13-14
• 1.3.2 人類博卡病毒的亞型14
• 1.3.3 人類博卡病毒的流行病學(xué)14-15
• 1.4 桿狀病毒的概述15-16
• 1.5 相關(guān)載體的概述16-18
• 1.5.1 pMal-c2x的概述16
• 1.5.2 pEGFP-N1的概述16-17
• 1.5.3 pFastBac1的概述17
• 1.5.4 pcDNA3.1(+)的概述17-18
• 1.6 本課題研究的目的及意義18-20
• 第二章 實(shí)驗(yàn)材料20-24
• 2.1 實(shí)驗(yàn)所需儀器和材料20
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器20
• 2.1.2 菌株、質(zhì)粒、細(xì)胞20
• 2.1.3 主要試劑20
• 2.2 常用培養(yǎng)基和溶液的配制20-24
• 2.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)基的配制20-21
• 2.2.2 DNA電泳所需溶液的配制21
• 2.2.3 堿裂解法提質(zhì)粒溶液的配制21
• 2.2.4 SDS-PAGE電泳溶液的配制21-22
• 2.2.5 Western Blot溶液的配制22
• 2.2.6 pMal-c2x蛋白純化溶液的配制22-23
• 2.2.7 各種抗生素的配制23
• 2.2.8 IPTG和X-gal的配制23
• 2.2.9 細(xì)胞培養(yǎng)所需溶液的配制23-24
• 第三章 實(shí)驗(yàn)方法24-35
• 3.1 人類博卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NP1重組桿狀病毒的制備24-27
• 3.1.1 引物設(shè)計(jì)和合成24
• 3.1.2 重組供體質(zhì)粒的構(gòu)建24-25
• 3.1.2.1 pFB-BoV-EGFP重組質(zhì)粒的構(gòu)建24-25
• 3.1.2.2 pFB-BoV-EGFP-NSl/NPl 重組質(zhì)粒的構(gòu)建25
• 3.1.3 Bac-BoV-EGFP、Bac-BoV-EGFp-NS1/NP1的制備與鑒定25-27
• 3.1.4 重組桿狀病毒Bac-BoV-EGFP、Bac-BoV-EGFP-NS1/NP1的制備27
• 3.2 人類博卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1抗原表位(C端1423-2172NT：750 BP)多克隆抗體的制備27-30
• 3.2.1 引物的設(shè)計(jì)和合成27
• 3.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及驗(yàn)證27-28
• 3.2.3 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)28
• 3.2.4 Western Blot驗(yàn)證融合蛋白28-29
• 3.2.4.1 SDS-PAGE蛋白電泳分離融合蛋白28
• 3.2.4.2 半干轉(zhuǎn)膜28-29
• 3.2.4.3 融合蛋白免疫檢測(cè)29
• 3.2.5 融合蛋白最佳誘導(dǎo)條件的確定29
• 3.2.6 融合蛋白的大量表達(dá)及Amylose親和純化29-30
• 3.2.6.1 融合蛋白的大量表達(dá)29
• 3.2.6.2 融合蛋白的純化29-30
• 3.2.7 多克隆抗體的制備30
• 3.3 人類博卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NP1在HELA細(xì)胞中核定位信號(hào)的初探30-33
• 3.3.1 引物的設(shè)計(jì)和合成30-32
• 3.3.2 pEGFP-N1-NP1截短重組質(zhì)粒的構(gòu)建32
• 3.3.3 觀察NP1蛋白在HeLa細(xì)胞中的熒光分布32-33
• 3.4 PCDNA3.1(+)-NP1截短重組質(zhì)粒的構(gòu)建33-35
• 3.4.1 引物設(shè)計(jì)和合成33-34
• 3.4.2 pcDNA3.1(+)-NP1截短重組質(zhì)粒的構(gòu)建34-35
• 第四章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-49
• 4.1 人類博卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NP1重組桿狀病毒的構(gòu)建35-39
• 4.1.1 目的基因的PCR擴(kuò)增35-36
• 4.1.1.1 HBoV+EGFP基因的PCR擴(kuò)增35
• 4.1.1.2 NS1/NP1基因的PCR擴(kuò)增35-36
• 4.1.2 供體質(zhì)粒的雙切及重組供體質(zhì)粒的驗(yàn)證36-37
• 4.1.2.1 pFB-BoV-EGFP重組質(zhì)粒的雙切處理36
• 4.1.2.2 pFB-BoV-EGFP-NS1/NP1重組供體質(zhì)粒的驗(yàn)證36-37
• 4.1.3 Bac-BoV-EGFP、Bac-BoV-EGFP-NS1/NP1重組bacmid驗(yàn)證37-38
• 4.1.4 重組桿狀病毒Bac-BoV-EGFP、Bac-BoV-EGFP-NS1/NP1的制備38-39
• 4.2 人類博卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1抗原表位(C端1423-2172 NT：750 BP)多克隆抗體的制備39-43
• 4.2.1 PCR擴(kuò)增目的片段及載體雙切處理39-40
• 4.2.2 重組質(zhì)粒pMal-c2x-NS1截短的驗(yàn)證40-41
• 4.2.3 Western Blot驗(yàn)證融合蛋白41
• 4.2.4 融合蛋白最佳誘導(dǎo)條件的確定41-42
• 4.2.5 融合蛋白的大量表達(dá)及純化42-43
• 4.2.6 鑒定多克隆抗體43
• 4.3 人類博卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NP1在HELA細(xì)胞中核定位信號(hào)的初探43-47
• 4.3.1 PCR擴(kuò)增目的片段43-44
• 4.3.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和驗(yàn)證44-46
• 4.3.3 觀察NP1蛋白在HeLa細(xì)胞中的熒光分布46-47
• 4.4 PCDNA3.1(+)-NP1截短重組質(zhì)粒的構(gòu)建47-49
• 4.4.1 PCR擴(kuò)增目的片段47-48
• 4.4.2 pcDNA3.1(+)重組質(zhì)粒的構(gòu)建和驗(yàn)證48-49
• 第五章 討論49-51
• 參考文獻(xiàn)51-56
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文56-57
• 致謝57

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