本文關(guān)鍵詞：8型腺相關(guān)病毒所介導的GDNF與產(chǎn)酶基因?qū)?-OHDA損傷帕金森大鼠模型的保護與恢復性研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：帕金森疾病(Parkinson's disease, PD)是目前世界上最普遍的神經(jīng)退行性運動障礙疾病,且隨年齡的增加發(fā)病率隨之增高。病理上,帕金森病患者最主要的特征是黑質(zhì)致密部的多巴胺能神經(jīng)元減少,使黑質(zhì)-紋狀體通路中多巴胺(Dopamine, DA)釋放減少,造成紋狀體DA含量顯著降低。帕金森病的病因和發(fā)病機制目前尚不清楚。由于帕金森的發(fā)病機制的復雜性和多樣性,臨床上還沒有任何一種藥物最終可以減緩阻止甚至逆轉(zhuǎn)帕金森病患者中黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的變性過程,從而恢復黑質(zhì)紋狀體通路的正常功能。無論是藥物治療,手術(shù)治療或者神經(jīng)細胞移植治療,都不能對其有根治作用,而且還會帶來明顯的副作用。 由于帕金森病病變主要是黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的變性導致紋狀體內(nèi)多巴胺水平下降所致,又因為帕金森病患者的腦中病變的部位范圍小,因此帕金森病一直是神經(jīng)系統(tǒng)疾病中進行基因治療研究的熱門病種。本文采用產(chǎn)酶基因和保護基因,使得攜帶治療基因的重組病毒載體具備恢復多巴胺和保護受損細胞的功能,對6-OHDA制備的帕金森大鼠模型進行治療,以期達到最好的治療效果。 首先,選用膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF),其不僅有保護神經(jīng)細胞免受損傷的功能,又有使受損細胞恢復的能力。其次,選用神經(jīng)遞質(zhì)-多巴胺產(chǎn)生所必須的三個酶：AADC(芳香族氨基酸脫羧酶)、tTH(截短型酪氨酸羥化酶)、GCHI (GTP環(huán)化酶I)。這三個酶是產(chǎn)生多巴胺所必須的,將其導入紋狀體神經(jīng)細胞能夠代替受損的黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)產(chǎn)生多巴胺,可以使紋狀體發(fā)揮正常的功能。因此選用這四種基因,能夠從根本上恢復和保護黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng),使得帕金森癥狀得到緩解或者根治。 在基因治療所選用的病毒載體中,腺相關(guān)病毒(Adeno-associated virus,AAV)載體是目前最有效也最安全的帕金森基因治療的載體。目前來自人類的AAV血清型已經(jīng)發(fā)現(xiàn)12種,研究發(fā)現(xiàn)作為臨床研究和基因治療研究最廣泛的的AAV2對神經(jīng)組織的侵染率低,且85%的正常人群有針對AAV2的抗體。因此稀有型的AAV逐漸引起人們的注意。本文所采用的AAV8是目前發(fā)現(xiàn)的對黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)有最好的侵染性的病毒載體。同時選用了CAG啟動子,與一般啟動子相比,其具有在中樞神經(jīng)系統(tǒng)里高效且長期表達的能力。 本論文在設(shè)計實驗中,將作為輔助因子存在的GCHI用IRES連接在截短型TH(能夠使得外源調(diào)控更加有效)后面,使得tTH能夠和GCHI能夠一起發(fā)揮生成L-Dopa (Dopamine前體)的功能。其次,限于治療基因的長度,我們分別將GDNF和AADC單獨包裝,生成了AAV8-CAG-GDNF, AAV8-CAG-AADC和AAV8-CAG-tTH-IRES-GCH I三種8型重組從V病毒。體外實驗中,我們用Cos-7細胞驗證了產(chǎn)酶基因-AADC,tTH, GCH I的催化功能,與此同時用AAV8-CAG-zsGREEN在胎鼠的原代紋狀體細胞中證實了8型AAV病毒對紋狀體的良好的侵染效果。接著,我們制備了用6-OHDA制備了帕金森大鼠模型,經(jīng)條件優(yōu)化,成功率達到50%。然后將三種重組病毒按照預先設(shè)計分組注入模型鼠紋狀體,從行為學、免疫組化等方面評價帕金森大鼠的治療效果。 結(jié)果表明,與空白組相比,GDNF組、產(chǎn)酶基因組和聯(lián)合治療組模型鼠旋轉(zhuǎn)速度在治療后第四周下降約為24%、39%、47%,證實了聯(lián)合治療組比GDNF組和產(chǎn)酶基因組有更好的治療效果。其次,實驗組模型鼠紋狀體的冰凍切片和免疫組化顯示出重組病毒攜帶的目的基因具有較好的表達,且侵染區(qū)域能達到紋狀體的80%。因此本實驗設(shè)計達到了預期的目的,為后期的帕金森的基因治療奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：帕金森病 基因治療 AAV8 GDNF 產(chǎn)酶基因
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R742.5;R-332
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 英文縮寫詞表12-13
• 第一章 前言13-26
• 1.1 帕金森病簡介13-16
• 1.1.1 帕金森病現(xiàn)狀13-14
• 1.1.2 帕金森病的致病機理14-16
• 1.2 帕金森疾病的治療手段16-18
• 1.2.1 藥物治療16
• 1.2.2 手術(shù)治療16-17
• 1.2.3 神經(jīng)細胞治療17-18
• 1.3 帕金森病的基因治療18-24
• 1.3.1 目的基因的選擇18-20
• 1.3.2 基因治療病毒載體20-23
• 1.3.3 啟動子選擇23-24
• 1.4 動物模型24-25
• 1.5 題依據(jù)25
• 1.6 實驗設(shè)計25-26
• 第二章 重組AAV質(zhì)粒的構(gòu)建與病毒包裝26-42
• 2.1 引言26
• 2.2 實驗材料26-29
• 2.2.1 實驗試劑26-27
• 2.2.2 實驗儀器27
• 2.2.3 實驗試劑配制方法27-29
• 2.3 實驗方法29-33
• 2.3.1 Trizol法提取總RNA29-30
• 2.3.2 逆轉(zhuǎn)錄操作30
• 2.3.3 感受態(tài)細胞制備30-31
• 2.3.4 轉(zhuǎn)化操作步驟31-32
• 2.3.5 轉(zhuǎn)染細胞32
• 2.3.6 Western Blot32-33
• 2.3.7 重組AAV病毒包裝及純化33
• 2.3.8 病毒基因組提取33
• 2.4 實驗結(jié)果與討論33-41
• 2.4.1 AAV8-CAG-GDNF重組載體構(gòu)建及表達鑒定34-35
• 2.4.2 AAV8-CAG-AADC重組載體構(gòu)建及表達鑒定35-36
• 2.4.3 AAV8-CAG-tTH-IRES-GCH Ⅰ重組載體構(gòu)建及表達鑒定36-38
• 2.4.4 檢測三種重組病毒的包裝效果38-41
• 2.5 本章小結(jié)41-42
• 第三章 體外檢測基因表達的蛋白活性42-51
• 3.1 引言42
• 3.2 實驗材料42-43
• 3.2.1 實驗儀器42
• 3.2.2 實驗細胞與試劑42-43
• 3.2.3 溶液配制43
• 3.3 實驗方法43-45
• 3.3.1 酶活檢測43
• 3.3.2 色譜條件43-44
• 3.3.3 標準品的測定44
• 3.3.4 實驗組樣品含量測定44
• 3.3.5 紋狀體細胞培養(yǎng)44-45
• 3.4 實驗結(jié)果與分析45-50
• 3.4.1 標準曲線的測定45-46
• 3.4.2 酶活檢測結(jié)果46-48
• 3.4.3 胎鼠紋狀體細胞的培養(yǎng)48-50
• 3.5 本章小結(jié)50-51
• 第四章 帕金森大鼠模型制備與治療51-64
• 4.1 引言51
• 4.2 實驗材料與方法51-54
• 4.2.1 實驗材料51
• 4.2.2 實驗方法51-54
• 4.3 實驗結(jié)果與討論54-63
• 4.3.1 大鼠造模及實驗分組54-55
• 4.3.2 AAV8-CAG-zsGREEN病毒對紋狀體的侵染55-56
• 4.3.3 病毒注射后模型鼠旋轉(zhuǎn)數(shù)據(jù)56-61
• 4.3.4 免疫組化61-63
• 4.4 本章小結(jié)63-64
• 第五章 結(jié)論64-66
• 5.1 討論64-65
• 5.2 結(jié)論65-66
• 參考文獻66-71
• 作者簡介71-72
• 致謝72-73

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前9條

1 王磊;郭紀鋒;嚴新翔;;帕金森病基因治療新進展[J];國際神經(jīng)病學神經(jīng)外科學雜志;2008年02期

2 葉楠;徐蕾;吳曉黎;;腦深部電刺激術(shù)治療帕金森病的副作用[J];國際神經(jīng)病學神經(jīng)外科學雜志;2010年04期

3 梁希彬,羅涌,李豐橋,王曉民;帕金森病回顧與展望[J];科學通報;2000年22期

4 趙麗琴;席斌;彭華松;;腺相關(guān)病毒(AAV)載體研究進展[J];生物技術(shù)進展;2012年02期

5 安懷杰;俞煒源;孫志偉;;內(nèi)部核糖體進入位點及其研究進展[J];生物技術(shù)通訊;2007年04期

6 吳均,楊慧;帕金森病動物模型研究進展[J];中國比較醫(yī)學雜志;2005年02期

7 盧芳;劉樹民;楊婷婷;;帕金森病的最新國內(nèi)外研究進展[J];中國老年學雜志;2009年09期

8 付守鵬;李蘇楠;李洋;李志強;楊占清;陳巍;王瑋;柳巨雄;;β-羥丁酸抑制下丘腦神經(jīng)細胞PIF基因表達和蛋白分泌[J];中國獸醫(yī)學報;2012年02期

9 陳睿;孫志軍;孟憲國;劉雪平;;IRES序列連接的人GDNF基因和EGFP基因逆轉(zhuǎn)錄病毒真核表達載體的構(gòu)建及鑒定[J];中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志;2010年21期

  本文關(guān)鍵詞：8型腺相關(guān)病毒所介導的GDNF與產(chǎn)酶基因?qū)?-OHDA損傷帕金森大鼠模型的保護與恢復性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：388039