本文關(guān)鍵詞：細(xì)菌AcrAB-TolC外排泵在幽門螺桿菌耐藥中的作用及機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景及目的： 幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，H.pylori）屬于革蘭氏陰性菌，目前世界上有數(shù)十億人感染了H.pylori，它是公認(rèn)的人類慢性胃炎及消化性潰瘍的致病原，與胃粘膜相關(guān)淋巴組織（MALT）淋巴瘤及胃癌密切相關(guān)。H.pylori在人群中的感染非常普遍，并且必須依靠抗生素的使用才能將其根除，否則感染將持續(xù)終生，但隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，H.pylori的耐藥情況日趨嚴(yán)重，并且出現(xiàn)了同時(shí)對(duì)三種或三種以上抗生素耐藥的多重耐藥菌株（multidrug resistant.MDR），如何克服H.pylori的耐藥，提高其根除率已成為一世界性難題。近年研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌外排泵系統(tǒng)在H.pylori耐藥尤其多重耐藥性中起重要作用，與細(xì)菌多重抗生素耐藥性有關(guān)的主動(dòng)外排泵系統(tǒng)主要有5個(gè)家族，其中的RND類中AcrAB-TolC外排泵是革蘭氏陰性細(xì)菌產(chǎn)生多重耐藥最主要的占優(yōu)勢(shì)的外排系統(tǒng)，是許多革蘭氏陰性細(xì)菌產(chǎn)生耐藥尤其是多重耐藥的主要機(jī)制。 為了探討AcrAB-TolC外排泵在H.pylori多重耐藥中的作用，本文觀察了臨床分離的H.pylori MDR菌株和對(duì)常用的9種抗生素全敏感H.pylori菌株AcrAB-TolC外排泵相關(guān)蛋白編碼基因mRNA的表達(dá)差異，并觀察了了H.pyloriMDR菌株其相對(duì)應(yīng)的抗生素耐藥基因的突變，同時(shí)研究了幾種常見的外排泵抑制劑對(duì)H.pylori MDR株耐藥性的影響，力圖闡明AcrAB-TolC外排泵在H.pylori多重耐藥中的作用。 方法： 1、H.pylori菌株的選擇：在本實(shí)驗(yàn)室保存的653株H.pylori臨床分離株中篩選出10株對(duì)3類/3類以上抗生素耐藥的MDR株（耐藥組）和10株對(duì)9種常用抗生素全敏感株（敏感組）。通過E-test法和K-B紙片擴(kuò)散法重新確認(rèn)和驗(yàn)證這20株H.pylori對(duì)抗生素的敏感性。 2、AcrAB-TolC外排泵相關(guān)蛋白編碼基因mRNA的檢測(cè)：采用q-PCR方法，以gyrB作為參比基因，檢測(cè)兩組細(xì)菌AcrAB-TolC外排泵相關(guān)蛋白編碼基因hefA、hefB、hefC、hefD、hefE、hefF、hefG、hefH、hefI、HP1489、HP1488mRNA的相對(duì)表達(dá)量，，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，并利用SPSS17.0軟件將上述基因的表達(dá)量與5種H.pylori易產(chǎn)生耐藥的抗生素對(duì)應(yīng)的MIC進(jìn)行線性相關(guān)性分析。 3、克拉霉素、左氧氟沙星和甲硝唑特異性耐藥基因的檢測(cè)：依據(jù)目前公認(rèn)的耐藥相關(guān)基因?qū)DR株進(jìn)行基因檢測(cè)，克拉霉素檢測(cè)23S rRNA；甲硝唑檢測(cè)rdxA和frxA；左氧氟沙星檢測(cè)gyrA。對(duì)耐藥菌株相關(guān)基因行PCR擴(kuò)增后進(jìn)行DNA測(cè)序分析。步驟如下：①提取H.pylori基因組DNA；②查GeneBank得23SrRNA、rdxA、frxA、gyrA基因，利用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物。以上面提取的染色體DNA為模版進(jìn)行PCR；③DNA測(cè)序和生物信息學(xué)分析：PCR產(chǎn)物測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果利用primer Premier5及AlignX軟件等生物信息學(xué)軟件，以H.pylori標(biāo)準(zhǔn)株J99為參照，進(jìn)行生物信息學(xué)分析。 4、外排泵抑制劑對(duì)H.pylori MDR株對(duì)抗生素敏感影響的分析：分別在Muller-Hinton培養(yǎng)基中加入以下各種不同作用機(jī)制的外排泵抑制劑：底物競(jìng)爭(zhēng)性抑制PaβN（20mg/L），質(zhì)子動(dòng)力解偶聯(lián)劑CCCP(10mg/L)，質(zhì)子泵抑制劑奧美拉唑（10mg/L）、泮托拉唑（10mg/L）、蘭索拉唑（10mg/L）、埃索美拉唑（10mg/L）及雷貝拉唑（10mg/L），然后行藥敏試驗(yàn)，觀察外排泵抑制劑對(duì)H.pylori MDR菌株菌株MIC的影響。以加入泵抑制劑后抗生素MIC下降≥4倍為陽性標(biāo)準(zhǔn)，認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)果： 1、AcrAB-TolC外排泵相關(guān)蛋白編碼基因的表達(dá)：AcrAB-TolC外排泵相關(guān)蛋白編碼基因在所有敏感菌株中均未見高表達(dá)，而MDR株中有7株存在部分基因高表達(dá)的情況，所有基因的表達(dá)量在兩組間無明顯差異（P0.05）。具體結(jié)果：①hefA mRNA的相對(duì)表達(dá)量在敏感組和耐藥組分別為0.96±0.71和3.35±9.25，無顯著差異（P0.05），但耐藥組中R3菌株表達(dá)量高于29，敏感組所有菌株和其他MDR株表達(dá)量均低于3；②hefB mRNA的相對(duì)表達(dá)量在敏感組和耐藥組分別為1.13±0.73和4.20±7.22，無顯著差異（P0.05），但耐藥組R3及R5菌株表達(dá)量均高于10，敏感組所有菌株和其他MDR株表達(dá)量均低于3；③hefC mRNA的相對(duì)表達(dá)量在敏感組和耐藥組分別為1.41±0.93和5.73±13.64，無顯著差異（P0.05），但耐藥組R3菌株表達(dá)量高于44，敏感組所有菌株和其他MDR株表達(dá)量均低于4；④hefD mRNA的相對(duì)表達(dá)量在敏感組和耐藥組分別為0.86±0.85和3.83±7.30，無顯著差異（P0.05），但耐藥組R1、R9菌株表達(dá)量均高于15，敏感組所有菌株和其他MDR株表達(dá)量均低于3；⑤hefE mRNA的相對(duì)表達(dá)量在敏感組和耐藥組分別為1.56±1.14和9.73±8.79，無顯著差異（P0.05），但耐藥組R1、R3及R9菌株表達(dá)量均高于16，敏感組所有菌株和其他MDR株表達(dá)量均低于4；⑥hefF mRNA的相對(duì)表達(dá)量在敏感組和耐藥組分別為0.76±0.68和5.30±9.42，無顯著差異（P0.05），但耐藥組R9、R10菌株表達(dá)量均高于22，敏感組所有菌株和其他MDR株表達(dá)量均低于4；⑦h(yuǎn)efG mRNA的相對(duì)表達(dá)量在敏感組和耐藥組分別為0.78±0.48和6.61±13.84，無顯著差異（P0.05），但耐藥組R3、R8及R10菌株表達(dá)量均高于6，敏感組所有菌株和其他MDR株表達(dá)量均低于2；⑧hefH mRNA的相對(duì)表達(dá)量在敏感組和耐藥組分別為1.23±0.66和4.38±7.40，無顯著差異（P0.05），但耐藥組R4、R10菌株表達(dá)量均高于12，敏感組所有菌株和其他MDR株表達(dá)量均低于3；⑨hefI mRNA的相對(duì)表達(dá)量在敏感組和耐藥組分別為1.12±0.80和0.85±0.58，無顯著差異（P0.05），所有菌株的表達(dá)量均低于3；⑩HP1489的相對(duì)表達(dá)量在敏感組和耐藥組分別為1.31±0.49和1.74±0.64，無顯著差異（P0.05），所有菌株的表達(dá)量均低于5； HP1488的相對(duì)表達(dá)量在敏感組和耐藥組分別為1.92±0.61和2.23±0.70，無顯著差異（P0.05），所有菌株的表達(dá)量均低于5。 2、AcrAB-TolC外排泵相關(guān)蛋白編碼基因的表達(dá)量與抗生素MIC的關(guān)系：AcrAB-TolC外排泵11個(gè)相關(guān)蛋白編碼基因的表達(dá)量與5種H.pylori易產(chǎn)生耐藥抗生素的MIC均無顯著相關(guān)性（P0.05）。 3、3種抗生素相關(guān)的特異性耐藥基因的檢測(cè)：①8株對(duì)克拉霉素耐藥的H.pylori MDR株均存在23SrRNA突變，突變形式均為為A2143G；②10株對(duì)左氧氟沙星耐藥的H.pylori MDR株均存在gyrA突變，突變形式以261位堿基缺失為主，另有幾株存在G271A及A272G形式的突變；③10株對(duì)甲硝唑耐藥的H.pyloriMDR株均存在rdxA和frxA突變，突變點(diǎn)散在分布，每株細(xì)菌的突變均影響了其翻譯的氨基酸序列。 4、外排泵抑制劑對(duì)H.pylori MDR株對(duì)抗生素敏感性的影響：①加入外排泵抑制劑PAβN后，10株H.pylori MDR株中有4株克拉霉素的MIC出現(xiàn)了4倍或4倍以上的變化；②加入外排泵抑制劑CCCP后，10株MDR株中有4株甲硝唑的MIC出現(xiàn)了4倍或4倍以上的變化，另有2株克拉霉素的MIC出現(xiàn)了4倍或4倍以上的變化；③加入質(zhì)子泵抑制劑（奧美拉唑、泮托拉唑、蘭索拉唑、埃索美拉唑及雷貝拉唑）后，抗生素對(duì)MDR株的MIC未發(fā)生變化。 結(jié)論： 1、AcrAB-TolC外排泵相關(guān)蛋白編碼基因在部分臨床分離的H.pylori MDR株中存在高表達(dá)，而所有臨床分離的H.pylori敏感株中未見高表達(dá)，且外排泵抑制劑能降低部分抗生素對(duì)H.pylori MDR株的MIC，提示AcrAB-TolC外排泵在H.pylori多重耐藥中起一定作用。 2、并不是所有的H.pylori MDR株均存在AcrAB-TolC外排泵相關(guān)蛋白編碼基因高表達(dá)，且后者的表達(dá)量與抗生素對(duì)H.pylori MDR株的MIC無顯著相關(guān)性，提示H.pyloriMDR的多重耐藥不是完全由AcrAB-TolC外排泵所致。 3、所有H.pylori MDR株的耐藥情況與耐藥基因突變的情況相符合，提示AcrAB-TolC外排泵與特異性耐藥突變共同介導(dǎo)了H.pylori MDR的多重耐藥。
【關(guān)鍵詞】：幽門螺桿菌 多重耐藥 細(xì)菌外排泵系統(tǒng) 外排泵抑制劑
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R378
【目錄】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-13
• 中英縮略詞表13-15
• 第1章 引言15-20
• 第2章 材料與方法20-32
• 2.1 材料20-23
• 2.1.1 細(xì)菌20
• 2.1.2 主要試劑20-22
• 2.1.3 主要儀器22
• 2.1.4 主要溶液配置22-23
• 2.2 方法23-31
• 2.2.1 細(xì)菌的蘇復(fù)、培養(yǎng)及鑒定23-24
• 2.2.2 檢測(cè) H.pylori 對(duì) 9 種抗生素的敏感性24-25
• 2.2.3 不同菌株 AcrAB-TolC 外排泵相關(guān)蛋白編碼基因表達(dá)量的檢測(cè)25-28
• 2.2.4 相對(duì)應(yīng)抗生素耐藥基因的測(cè)序28-30
• 2.2.5 測(cè)定外排泵抑制劑對(duì) H.pylori MDR 株耐藥性的影響30-31
• 2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理31-32
• 第3章 結(jié)果32-47
• 3.1 H.pylori 菌株的藥敏結(jié)果32-33
• 3.2 AcrAB-TolC 外排泵相關(guān)蛋白編碼基因 mRNA 表達(dá)量的檢測(cè)結(jié)果33-40
• 3.2.1 AcrAB-TolC 外排泵相關(guān)蛋白編碼基因的表達(dá)33-39
• 3.2.2 不同 H.pylori 菌株外排泵相關(guān)蛋白編碼基因表達(dá)量與抗生素MIC 的相關(guān)性39-40
• 3.3 與 3 種抗生素耐藥相關(guān)的耐藥基因檢測(cè)結(jié)果40-42
• 3.3.1 PCR 結(jié)果40-41
• 3.3.2 PCR 產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果及分析41-42
• 3.4 外排泵抑制劑對(duì) H.pylori MDR 株耐藥性的影響42-47
• 3.4.1 PAβN 對(duì) H.pylori MDR 株耐藥性的影響42-43
• 3.4.2 CCCP 對(duì) H.pyloriMDR 株耐藥性的影響43-44
• 3.4.3 奧美拉唑?qū)?H.pylori MDR 株耐藥性的影響44
• 3.4.4 蘭索拉唑?qū)?H.pylori MDR 株耐藥性的影響44-45
• 3.4.5 泮托拉唑?qū)?H.pylori MDR 株耐藥性的影響45-46
• 3.4.6 雷貝拉唑?qū)?H.pylori MDR 株耐藥性的影響46
• 3.4.7 埃索美拉唑?qū)?H.pylori MDR 株耐藥性的影響46-47
• 第4章 討論47-52
• 4.1 AcrAB-TolC 外排泵相關(guān)蛋白編碼基因在 H.pylori MDR 株中的表達(dá)47-48
• 4.2 抗生素特異性耐藥基因在 H.pylori MDR 菌株株中的變化48-49
• 4.3 外排泵抑制劑對(duì) H. pylori MDR 菌株對(duì)抗生素敏感性的影響49-52
• 第5章 實(shí)驗(yàn)結(jié)論52-53
• 致謝53-54
• 參考文獻(xiàn)54-57
• 綜述57-63
• 參考文獻(xiàn)61-63

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