目的:用雙分子熒光互補(bǔ)及免疫共沉淀技術(shù)驗(yàn)證HIP-55與14-3-3在HEK293細(xì)胞中存在相互作用,并進(jìn)一步研究其生物學(xué)意義。方法:利用GATEWAY系統(tǒng)構(gòu)建PDEST-N-Venus-HIP-55WT(野生型),PDEST-N-VenusHIP-55AA(突變體S269A/T291A),PDEST-GST-HIP-55WT及PDEST-C-Venus-14-3-3τ重組質(zhì)粒,利用雙分子熒光互補(bǔ)及免疫共沉淀技術(shù)檢測兩者的相互作用,同時(shí)應(yīng)用14-3-3蛋白相互作用抑制肽R18和HIP-55蛋白突變體(HIP-55AA突變體S269A/T291A不能與14-3-3相互作用)作為工具研究兩者結(jié)合后對嘌呤霉素誘導(dǎo)的HIP-55蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果:外源轉(zhuǎn)入的Venus-HIP-55WT、Venus-HIP-55AA及Venus-14-3-3蛋白能夠在HEK293細(xì)胞中表達(dá);雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HIP-55與14-3-3存在相互作用,HIP-55蛋白的S269/T291位點(diǎn)介導(dǎo)HIP-55與14-3-3的相互作用;免疫共沉淀技術(shù)表明內(nèi)源性HIP-55與14-3-3存在相互作用;進(jìn)一步研究...

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【文章目錄】：
1 材料與方法
    1. 1 雙分子熒光互補(bǔ)( bimolecular fluorescence complementation,Bi FC) 分析重組質(zhì)粒構(gòu)建
    1. 2 雙分子熒光互補(bǔ)( Bi FC) 分析
    1. 3免疫共沉淀( co-immunoprecipitation,co-IP) 檢測
    1. 4 免疫印跡
2 結(jié)果
    2. 1 雙分子熒光互補(bǔ)分析重組蛋白的表達(dá)
    2. 2 雙分子熒光互補(bǔ)( Bi FC) 分析HIP-55 與14-3-3相互作用( 圖2)
    2. 3 免疫共沉淀技術(shù)證明HIP-55 與14-3-3 存在相互作用
    2. 414-3-3 與HIP-55 形成蛋白質(zhì)復(fù)合物后增強(qiáng)HIP-55 蛋白的穩(wěn)定性
3 討論



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