發(fā)布時間：2017-05-22 14:10

  本文關(guān)鍵詞：基于量子點(diǎn)的新型均相時間分辨熒光免疫分析技術(shù)的建立及初步應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景與目的 免疫分析方法是指利用抗原與抗體之間的特異性結(jié)合反應(yīng)實(shí)現(xiàn)對相對應(yīng)的抗體、抗原或是相關(guān)物質(zhì)進(jìn)行定性或定量檢測的分析方法。免疫分析被廣泛地應(yīng)用于食品及環(huán)境分析,生物及醫(yī)學(xué)研究,臨床診斷等領(lǐng)域。免疫分析技術(shù)根據(jù)待測物是否懸浮在分析樣品中的不同,分為均相與非均相(或固相)。目前免疫分析主要以微孔板為實(shí)驗(yàn)平臺的非均相分析模式。一般而言,非均相分析(如ELISA,TRFIA)整個操作過程步驟多,緩慢的異相免疫反應(yīng)體系,多次洗滌來分離結(jié)合標(biāo)記與游離標(biāo)記,耗費(fèi)時間長,不易自動化等缺點(diǎn)。因此,這種方法不能滿足某些快速檢測和診斷的要求。而相反,均相免疫分析不需要分離,能夠直接識別和測定免疫反應(yīng)樣品中的待測物(抗體或者抗原),比較容易實(shí)現(xiàn)微型化和自動化。均相免疫分析避免了因?yàn)闆_洗帶來的檢測不穩(wěn)定性和低靈敏度,更大大提高了檢測效率,適宜開發(fā)快速高通量自動化檢測技術(shù)。 甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)是一種單鏈多肽糖蛋白,也是一種主要在胎兒發(fā)育過程中卵黃囊和肝臟分泌的血漿白蛋白。甲胎蛋白濃度峰值是在胎兒時期,隨后在8-12個月逐漸降低,可降至健康成人水平,以后在沒有疾病的情況下,終生將維持低水平。監(jiān)測孕婦血中甲胎蛋白濃度常作為胎兒畸形的篩選指標(biāo)。由于肝細(xì)胞癌、卵黃囊和胚胎性腫瘤及部分肝外腫瘤可重新合成甲胎蛋白。因此在臨床上,AFP常用于原發(fā)性肝癌或是非肝癌(包括消化、呼吸、泌尿生殖等多系統(tǒng)器官惡性腫瘤)的檢測指標(biāo)。其次,AFP常用于肝炎、肝硬化等急慢性肝病診斷、病情監(jiān)測。此外臨床上還常聯(lián)合其他檢測方法用于出生缺陷的產(chǎn)前篩查、胚胎瘤、母細(xì)胞瘤診斷。以期到達(dá)早期識別疾病,有助于減少死亡率、改善存活率和大力普及優(yōu)生優(yōu)育。 量子點(diǎn)(Quantum dots, QDs)又稱半導(dǎo)體納米顆粒,由于其具有寬激發(fā)譜、窄發(fā)射峰、多色性及抗光漂白性等諸多優(yōu)點(diǎn),使其成為重要的熒光標(biāo)記物用于現(xiàn)代均相免疫分析技術(shù)中。研究內(nèi)容與方法 本文旨在利用半導(dǎo)體材料量子點(diǎn)(Quantum dots, QDs)微球作為標(biāo)記探針,并結(jié)合稀土金屬螯合物鋱(Luminescent terbium chelates, LTCs)的時間分辨熒光,在熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence resonance energy transfer, FRET)原理下,對熒光共振能量轉(zhuǎn)移供體(Donor)與受體(Receptor)的表面進(jìn)行處理,以甲胎蛋白(AFP)為例,建立一種高靈敏度、低信噪比的均相免疫分析法。主要研究工作包括如下三個方面： 1、量子點(diǎn)微球的制備。為了能將硒化鎘/硫化鋅(CdSe/ZnS)量子點(diǎn)運(yùn)用到本課題中,我們采用量子點(diǎn)高通量編碼慣用的方法：羧基化聚苯乙烯微球(Carboxyl-functionalized polystyrene microspheres, CPs)經(jīng)過三氯甲烷/異丙醇的溶脹,包埋脂溶性量子點(diǎn),進(jìn)而制得本研究所需的表面羧基功能化的量子點(diǎn)聚苯乙烯微球(QPs)。同時,所制備得到的表面功能化的熒光復(fù)合微球具有高熒光強(qiáng)度,并能夠在常用PBS緩沖溶液中穩(wěn)定地貯存4℃。 2、鋱螯合物的合成。運(yùn)用原始化學(xué)材料二乙三胺五乙酸二酐(DTPA,A), TbCl3, CS124來合成鋱螯合物配體ITC-DTPA-Tb3+。 3、對熒光共振能量轉(zhuǎn)移受體(Donor)與受體(Receptor)進(jìn)行表面化學(xué)修飾,以期消除非特異性吸附或防止聚集沉淀。一方面,聚苯乙烯微球(CPs)本身就是一種非特異性極強(qiáng)的物質(zhì),盡管其表面進(jìn)過了羧基的水溶性修飾,但經(jīng)過了三氯甲烷／異丙醇的多次溶脹而吸附脂溶性量子點(diǎn)后,其親水表面已部分破壞。這樣的話,其非特異性吸附能力極大,尤其是在檢測抗原或抗體時候表現(xiàn)出來,對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成極大影響。另一方面,鋱螯合物供體本身是一個多羧酸基和酯基團(tuán)的螯合劑與鋱金屬離子(Tb3+)形成的,具有水溶膠性質(zhì),表面富有的陰離子同電荷靜電排斥力促使鋱螯合物很難與受體或生物分子學(xué)發(fā)生非特異性吸附或聚集,其表面已排除了非特異性吸附的可能。因此,本研究的還要對量子點(diǎn)納米微球表面進(jìn)行化學(xué)修飾,使其盡可能多的帶有親水基團(tuán),從而避免非特異性吸附。 4、利用雙抗體夾心法,在熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)原理下,羧基聚苯乙烯量子點(diǎn)微球(QPs)和鋱螯合物(LTCs)分別標(biāo)記兩株AFP單克隆抗體之后,建立雙抗體夾心模式的定量測定AFP標(biāo)準(zhǔn)品中AFP的均相免疫分析法。 研究結(jié)果： 采用雙抗體夾心法模式,充分利用兩株抗體與AFP抗原的相互作用,從而驗(yàn)證QPs、LTCs兩者與抗體偶聯(lián)的生物活性,并研究QDs用于均相熒光共振能量轉(zhuǎn)移(HTR-FRET)免疫分析中的可行性與實(shí)用性。結(jié)果表明,LTCs與QPs之間能夠發(fā)生能量轉(zhuǎn)移,其熒光共振能量轉(zhuǎn)移信號與AFP濃度成線性相關(guān),其工作曲線為LogY=3.65786+0.43863·log X(R=0.996,P0.01),并計算出其分析靈敏度為0.4ng/mL。該新型均相熒光免疫分析方法具有不需沖洗掉游離熒光標(biāo)記物,靈敏度高等優(yōu)勢,為今后實(shí)現(xiàn)快速便捷、多通道、高靈敏度、微量化、自動化及高通量化的生物醫(yī)學(xué)傳感技術(shù)和現(xiàn)代免疫分析技術(shù)提供科學(xué)依據(jù)。 研究結(jié)論： 本論文以稀土螯合物L(fēng)TCs作為能量供體標(biāo)記一株AFP單抗,QPs作為能量受體標(biāo)記另一株AFP單抗,建立了一種基于時間分辨FRET的均相免疫分析定量檢測甲胎蛋白的方法。該方法操作簡便,耗時較短(反應(yīng)時間約45min),且其線性范圍較寬(0.4～960ng/mL),可用于AFP抗原的篩選。
【關(guān)鍵詞】：量子點(diǎn) 甲胎蛋白 稀土金屬 熒光共振能量轉(zhuǎn)移 均相免疫分析
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-12
• 第一章 前言12-28
• 1.1 引言12-17
• 1.2 熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理17-20
• 1.3 熒光共振能量轉(zhuǎn)移供受體的選擇20-23
• 1.4 QPs-LTCs體系發(fā)生TR-FRET的可行性分析23-24
• 1.5 TR-FRET分析方法的應(yīng)用24-26
• 1.6 本文的研究目的及意義26-28
• 第二章 量子點(diǎn)納米微球的制備并與單克隆抗體偶聯(lián)28-44
• 2.1 引言28-32
• 2.2 硒化鎘/硫化鋅(CdSe/ZnS)量子點(diǎn)的制備32-35
• 2.3 量子點(diǎn)聚苯乙烯微球(QPs)的制備35-40
• 2.4 量子點(diǎn)納米微球的制備并與單克隆抗體偶聯(lián)40-44
• 第三章 時間分辨熒光鋱螯合物的制備44-51
• 3.1 引言44
• 3.2 實(shí)驗(yàn)部分44-51
• 第四章 QPs-LTCs體系均相時間分辨熒光分析51-66
• 4.1 原料與儀器51
• 4.2 均相時間分辨熒光免疫分析具體步驟51-52
• 4.3 QPs-LTCs均相時間分辨熒光免疫分析體系的優(yōu)化52-53
• 4.4 方法學(xué)評價53-54
• 4.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果54-61
• 4.6 討論61-65
• 4.7 本章總結(jié)65-66
• 參考文獻(xiàn)66-72
• 中英文縮寫詞72-74
• 致謝74-75
• 攻讀碩士學(xué)位期間參與發(fā)表論文75-76

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：基于量子點(diǎn)的新型均相時間分辨熒光免疫分析技術(shù)的建立及初步應(yīng)用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：385920