目的構(gòu)建Ser176/180磷酸化位點突變的核因子κB抑制劑激酶α(IKKα)真核表達載體。方法通過PCR獲得帶有IKKαSer176/180突變位點和無義突變KpnⅠ位點的片段,以及帶有無義突變KpnⅠ位點的片段,兩片段分別經(jīng)過HindⅢ/KpnⅠ以及KpnⅠ/EcoRⅠ雙酶切,載體pEGFP經(jīng)HindⅢ/EcoRⅠ雙酶切后連接。共聚焦顯微鏡技術(shù)觀察激活型/死型p EGFPIKKαKA/KD融合蛋白在真核細胞中的定位及其對P65核質(zhì)易位的影響。Western blot法檢測重組蛋白表達。結(jié)果測序顯示載體構(gòu)建成功。pEGFP-IKKαKA分布在細胞核和細胞質(zhì),并能使P65發(fā)生核穿梭。pEGFP-IKKαKD主要分布在細胞質(zhì),不能使P65發(fā)生核質(zhì)易位。Western blot結(jié)果顯示出融合蛋白的特異性條帶。結(jié)論成功構(gòu)建IKKα磷酸化位點激活型及死型的真核表達載體,在真核細胞中可有效表達。pEGFP-IKKαKA/KD在真核細胞中蛋白表達呈現(xiàn)不同定位,對下游P65的核質(zhì)穿梭調(diào)控發(fā)揮不同效應(yīng)。

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【文章目錄】：
1材料和方法
    1. 1材料
    1. 2方法
2結(jié)果
    2.1重組質(zhì)粒構(gòu)建方法優(yōu)化示意圖
    2.2PCR擴增獲得目的基因
    2.3重組載體pEGFP-IKKαKA、pEGFP-IKKαKD酶切鑒定
    2.4pEGFP-IKKαKA、pEGFP-IKKαKD進一步酶切鑒定
    2.5pEGFP-IKKαKA和pEGFP-IKKαKD融合蛋白在細胞中的表達和定位
    2.6激酶突變重組載體的磷酸化功能驗證
3討論



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