本文關(guān)鍵詞：肝細胞核因子4α調(diào)控hepcidin的細胞實驗研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景 Hepcidin是一種由肝臟特異性表達的抗菌多肽，，同時是機體鐵代謝、吸收、儲存和利用環(huán)節(jié)的信號傳遞者，可負性調(diào)節(jié)如小腸上皮細胞、巨噬細胞等細胞鐵的輸出，抑制腸道細胞鐵的吸收和巨噬細胞鐵的釋放。作為一種鐵代謝調(diào)節(jié)激素，hepcidin在維持機體鐵穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著極為重要的作用。Hepcidin作為維持機體鐵穩(wěn)態(tài)的中心調(diào)控因子，對其調(diào)控機制研究一直是鐵代謝研究的熱點。 流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）病人通常伴隨著肝鐵過負荷（hepatic iron overload，HIO），而HIO又通過促進肝臟纖維化和膽固醇的升高加快了肝病的發(fā)展。NAFLD病人的血清和肝臟hepcidin水平顯著高于正常對照人群，但對于其自身的鐵水平來說，hepcidin的量相對不足，即NAFLD患者hepcidin/血清鐵蛋白（serum ferritin，SF）或hepcidin/機體鐵評分（total iron score，TIS）的比值低于正常人群。Hepcidin對鐵的反應(yīng)能力的降低已被證明在促進其他代謝性疾病，如2型糖尿病中的HIO發(fā)揮重要的作用，且其降低的程度與2型糖尿病患者HIO程度呈相關(guān)性。但是，引起NAFLD患者hepcidin相對不足的機制尚不清楚。 肝細胞核因子4α（hepatocyte nuclear factor4α，HNF-4α）是高度保守的孤兒受體家族成員之一，主要在肝臟內(nèi)表達。HNF-4α可調(diào)節(jié)糖、脂及膽汁酸等物質(zhì)的代謝，是糖脂代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子。Courselaud等發(fā)現(xiàn)肝臟HNF-4α特異性敲除后的大鼠肝臟hepcidin mRNA表達升高。但是HNF-4α究竟通過何種機制調(diào)控hepcidin表達的尚未得出明確的結(jié)論。 研究目的 本課題在細胞水平進一步研究了HNF-4α對hepcidin表達的影響，并初步闡明其作用機制，以進一步完善hepcidin的調(diào)控機制，為初步闡明NAFLD中hepcidin相對不足的原因提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。 研究方法 一、細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 HepG2肝癌細胞株用含10%胎牛血清，1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)液于37°C，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按照說明書將HNF-4α或/和BMPR1A的siRNA以及無效RNA分別與Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑混合后孵育，與HepG2細胞一起加入到含正常血清但不含雙抗的培養(yǎng)液中。轉(zhuǎn)染12小時后可換成含雙抗的全培養(yǎng)液，再培養(yǎng)36小時即可檢測。HNF-4α過表達是通過FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑將過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HepG2細胞中的。 二、染色質(zhì)免疫共沉淀 染色質(zhì)免疫共沉淀實驗采用Upstate公司生產(chǎn)的試劑盒完成，實驗步驟按照其所提供的實驗說明書。 三、報告基因?qū)嶒?將野生型hepcidin啟動子近端序列、SMAD4結(jié)合位點突變型hepcidin啟動子序列和HNF-4α結(jié)合位點敲除型hepcidin啟動子序列分別與從HepG2細胞中抽提的pGL3-basic質(zhì)粒整合為所需的熒光素酶報告基因質(zhì)粒。按照FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑使用說明書將質(zhì)粒與HNF-4α過表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至HepG2細胞中。含海腎報告基因的質(zhì)粒pRL-SV40被同時轉(zhuǎn)染至細胞，以標準化排除轉(zhuǎn)染效率對結(jié)果的影響。轉(zhuǎn)染48小時后，檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性。 四、實時定量熒光PCR實驗 實時定量熒光PCR的方法檢測轉(zhuǎn)染HNF-4α siRNA或過表達質(zhì)粒后的HepG2細胞的HNF-4α和hepcidin的mRNA水平。用TRIzol從HepG2細胞中抽提總RNA，之后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。將cDNA與SYBRGREEN、引物混合后用ABI Prism7300檢測系統(tǒng)檢測mRNA水平并用β-actin含量對其標準化。 五、Western Blotting實驗 分別向HepG2細胞中轉(zhuǎn)染HNF-4α siRNA或HNF-4α過表達質(zhì)粒，培養(yǎng)48小時后用凱基全蛋白提取試劑盒抽提蛋白。采用Western Blotting法測定HNF-4α、hepcidin、SMAD1、pSMAD1/5/8、SMAD4、STAT3、pSTAT3、SMAD6、SMAD7、BMP2、BMP4、BMPR1A、BMPR1B、BMPR2、ActR2A、ActR2B、HJV的蛋白含量，并用β-actin或相應(yīng)磷酸化蛋白含量標準化。 六、數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 實驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用SPSS v18.0軟件進行統(tǒng)計分析。兩組數(shù)據(jù)間的比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時各組樣本均數(shù)間兩兩比較采用LSD-t檢驗，各實驗組間與對照組比較采用Dunnett法。p0.05認為有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果 一、HNF-4α對HepG2細胞hepcidin表達的影響 HepG2轉(zhuǎn)染HNF-4α siRNA或過表達質(zhì)粒后，用Western Blotting方法檢測hepcidin蛋白表達水平，實時熒光定量PCR檢測hepcidin mRNA表達水平。與對照組相比，干擾HNF-4α后hepcidin蛋白水平和mRNA均顯著升高，而過表達HNF-4α后hepcidin蛋白水平和mRNA則相應(yīng)降低。二、HNF-4α對hepcidin啟動子結(jié)合位點的結(jié)合作用 已經(jīng)有研究報道hepcidin啟動子序列上有兩個HNF-4α的可能結(jié)合位點，我們首先用染色質(zhì)免疫共沉淀（chIP）的方法檢測HNF-4α是否可以與其結(jié)合。結(jié)果顯示HNF-4α可以與hepcidin啟動子上的近端HNF-4α結(jié)合位點（PotentialHRE2）結(jié)合。然后，我們通過報告基因?qū)嶒炞C明HNF-4α與hepcidin啟動子上的近端HNF-4α結(jié)合位點（Potential HRE2）的結(jié)合是否具有活性。我們分別將野生型的hepcidin啟動子和近端HNF-4α結(jié)合位點（Potential HRE2）敲除后的hepcidin啟動子與HNF-4α過表達質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染至HepG2細胞。檢測結(jié)果顯示HNF-4α過表達質(zhì)�？梢允挂吧蚳epcidin啟動子的熒光素酶報告基因活性顯著降低，但是將HNF-4α結(jié)合位點（Potential HRE2）敲除后HNF-4α過表達質(zhì)粒仍可以顯著降低其熒光素酶報告基因活性。 三、HNF-4α抑制hepcidin表達的可能通路 STAT3和SMADs是已知調(diào)控hepcidin表達的主要調(diào)控因子。STAT3主要由IL-6介導(dǎo)，SMADs主要由BMPs介導(dǎo)。為了證明這兩條經(jīng)典通路是否參與了HNF-4α對hepcidin的調(diào)控，我們檢測了STAT3、SMAD1和SMAD4及其磷酸化的蛋白水平。結(jié)果顯示當HNF-4α過表達時，SMAD1的磷酸化蛋白——pSMAD1/5/8的水平顯著降低，而干擾HNF-4α?xí)rpSMAD1/5/8的水平顯著升高。而干擾和過表達HNF-4α后，SMAD1、SMAD4和STAT3、pSTAT3蛋白水平不變。 為了進一步證實BMP通路介導(dǎo)HNF-4α對hepcidin表達的影響，我們又做了染色質(zhì)免疫共沉淀實驗（chIP）和報告基因?qū)嶒�。ChIP實驗結(jié)果顯示，HNF-4αsiRNA顯著降低SMAD4與hepcidin啟動子的結(jié)合活性；而HNF-4α過表達質(zhì)粒則使SMAD4與hepcidin啟動子的結(jié)合活性顯著升高。但是HNF-4αsiRNA或HNF-4α過表達質(zhì)粒對STAT3與hepcidin啟動子的結(jié)合活性沒有影響。HNF-4α過表達質(zhì)�？梢允筯epcidin啟動子的報告基因活性顯著降低。但是，我們發(fā)現(xiàn)將hepcidin啟動子的SMAD4結(jié)合位點突變之后，HNF-4α過表達質(zhì)粒反而使hepcidin啟動子的熒光素酶報告基因活性升高。 四、I-SMADs和BMPs未介導(dǎo)HNF-4α對hepcidin的調(diào)控 SMAD6和SMAD7是BMP通路的抑制蛋白，通過與磷酸化的I型BMP受體結(jié)合從而抑制下游SMAD蛋白的磷酸化。為了進一步探討干擾或過表達HNF-4α后pSMAD1/5/8變化的原因，我們檢測了SMAD6、SMAD7以及BMP配體（BMP2和BMP4）的蛋白水平。我們發(fā)現(xiàn)，干擾或過表達HNF-4α后SMAD6、SMAD7和BMP2、BMP4蛋白水平均未改變。 五、BMPR1A介導(dǎo)HNF-4α對hepcidin表達的影響 為了研究HNF-4α是怎樣介導(dǎo)BMP通路對hepcidin表達的影響的，我們用Western Blotting檢測了I型BMP受體（BMPR1A、 BMPR1B），II型BMP受體（BMPR2、ActR2A和ActR2B），以及BMPs的共受體——HJV的蛋白水平。將HNF-4α干擾后，BMPR1A蛋白水平顯著升高，而過表達HNF-4α后，BMPR1A蛋白水平顯著降低； BMPR1B、BMPR2、ActR2A、ActR2B以及HJV蛋白水平不變。 為了進一步證實BMPR1A參與了HNF-4α對hepcidin表達的影響，我們將HNF-4α和/或BMPR1A siRNA轉(zhuǎn)染HepG2細胞。實驗結(jié)果顯示，單獨轉(zhuǎn)染HNF-4α， hepcidin蛋白水平顯著升高；而將BMPR1A的干擾后在干擾HNF-4αhepcidin蛋白水平不再升高。
【關(guān)鍵詞】：肝細胞核因子4α 鐵調(diào)素 骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體1A 鐵過負荷 非酒精性脂肪肝
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 摘要5-9
• Abstract9-14
• 主要英文縮略詞表14-15
• 前言15-16
• 一、材料與方法16-28
• 二、結(jié)果28-40
• 三、討論40-44
• 參考文獻44-48
• 綜述48-58
• 參考文獻53-58
• 在讀期間發(fā)表論文和參加科研情況58-59
• 致謝59

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

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本文編號：384168