本文關(guān)鍵詞：GSK-3β在高糖環(huán)境下足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化效應(yīng)中的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景 糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病患者最常見的微血管并發(fā)癥之一,也是導(dǎo)致終末期腎臟病(end-stage renal disease, ESRD)的重要原因。蛋白尿是DN最常見的臨床表現(xiàn),也是糖尿病腎病進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,因此減少蛋白尿是糖尿病腎病治療的重要舉措。足細(xì)胞是腎小球?yàn)V過屏障的重要組成部分,其結(jié)構(gòu)和功能的改變?cè)贒N蛋白尿的發(fā)生、發(fā)展過程中起到了關(guān)鍵的作用。足細(xì)胞參與蛋白尿形成的原因很多,機(jī)制復(fù)雜。作為一種終末分化的臟層上皮細(xì)胞,足細(xì)胞在某些刺激物的作用下可通過特定程序向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT),但足細(xì)胞在高糖環(huán)境下是否發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化以及足細(xì)胞的間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化是否參與蛋白尿的形成尚不清楚。 目前研究認(rèn)為,有三條信號(hào)通路介導(dǎo)了足細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化過程,即TGF-β/smad、integrin/ILK和Wnt/β-catenin,而廣泛存在于真核生物體內(nèi)的糖原合成酶激酶3β (glycogen synthase kinase3β, GSK-3β)是以上三條通路的參與者,但其是否參與高糖環(huán)境下足細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化目前尚不明確。 無(wú)機(jī)離子鋰(本課題使用氯化鋰)是一種治療狂躁和抑郁癥的藥物,是GSK-3β的選擇性活性抑制劑,通過鋰的作用,抑制高糖環(huán)境下GSK-3β的活性,并觀察足細(xì)胞表型和功能的變化,或許能為糖尿病腎病蛋白尿?qū)ふ倚碌闹委煱悬c(diǎn)。 目的 本實(shí)驗(yàn)通過觀察高糖環(huán)境下小鼠足細(xì)胞表型和功能的改變、GSK-3β表達(dá)量和活性的改變、以及抑制GSK-3β活性和表達(dá)量后足細(xì)胞表型和功能的變化,來研究GSK-3β在高糖環(huán)境下足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化效應(yīng)中的作用,并為糖尿病腎病蛋白尿的治療尋找新的靶點(diǎn)。 方法 以條件永生化小鼠足細(xì)胞為研究對(duì)象。 1.高糖環(huán)境下檢測(cè)足細(xì)胞表型和功能： (1)不同濃度葡萄糖對(duì)足細(xì)胞表型的影響：用含不同濃度葡萄糖(12.5、25、50mmol/L)的1640培養(yǎng)基處理足細(xì)胞36h,并設(shè)正常對(duì)照組(5.6mmol/L葡萄糖)和高滲對(duì)照組(5.6mmol/L葡萄糖+44.4mmol/L甘露醇),采用Western-blot與間接免疫熒光的方法檢測(cè)足細(xì)胞表面標(biāo)記蛋白nephrin,podocin和間充質(zhì)細(xì)胞表型標(biāo)志物α-SMA,Fibronectin的表達(dá)； (2)不同濃度葡萄糖刺激足細(xì)胞36h后白蛋白流入量的變化：將分化成熟的足細(xì)胞以一定密度(5×10~3)接種于transwell小室上層的聚酯纖維膜上,待細(xì)胞融合后,換無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓8小時(shí),然后使用含不同濃度葡萄糖(5.6、12.5、25、50mmol/L)的1640培養(yǎng)基處理足細(xì)胞36小時(shí),36h后使用滅菌PBS洗滌細(xì)胞兩次,然后給Transwell濾過膜的上部換上0.3ml的RPMI1640培養(yǎng)基,下部充滿1ml含40mg/ml胎牛血清白蛋白的RPMI1640培養(yǎng)基,于37℃孵育1小時(shí)后,取上層培養(yǎng)液,用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定濾過膜上部培養(yǎng)基的白蛋白濃度,即白蛋白流入量。 2.高糖環(huán)境下足細(xì)胞GSK-30表達(dá)量及活性的變化： (1)不同濃度葡萄糖(5.6、12.5、25、50mmol/L Glu)處理足細(xì)胞36h后,用Western-blot檢測(cè)GSK-3β及其9位絲氨酸位點(diǎn)pSer9GSK-3β(抑制位點(diǎn))的表達(dá)量以及216位酪氨酸位點(diǎn)pTyr216GSK-3β(活化位點(diǎn))的表達(dá)量； (2)不同糖濃度處理的足細(xì)胞GSK-3β活性的變化：足細(xì)胞按上述濃度分組培養(yǎng)36h后,按照GSK-3β活性檢測(cè)試劑盒(Genmed Scientific,美國(guó))說明書處理足細(xì)胞,依次加入各種試劑,于分光光度計(jì)上檢測(cè)各組樣品的OD值,按試劑盒說明書給出的公式計(jì)算GSK-3β的活性。 3.應(yīng)用siRNA干擾GSK-3p后檢測(cè)足細(xì)胞表型及功能： 根據(jù)Gene Bank數(shù)據(jù)庫(kù)提供的小鼠的GSK-3β全長(zhǎng)基因(Gene Bank NO.NM-019827.6)由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)的靶序列mRNA(5’-3’)為：CCACTCAAGAACTGTCAAGTA.,陰性對(duì)照的siRNA正義鏈(5’-3’)序列為：UUCUCCGAACGUGUCACGUtt。應(yīng)用轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000(invitrogen,美國(guó))將GSK-3βsiRNA以30nmol的濃度轉(zhuǎn)染足細(xì)胞36小時(shí)后檢測(cè)各組足細(xì)胞nephrin,podocin,a-SMA表達(dá)量的變化；同時(shí)應(yīng)用Transwell檢測(cè)各組的白蛋白流入量以評(píng)估足細(xì)胞的單層屏障功能。 4.應(yīng)用GSK-30活性抑制劑后足細(xì)胞表型及功能的變化 應(yīng)用LiCl,一種經(jīng)典的GSK-3β活性抑制劑,觀察抑制GSK-3p活性后足細(xì)胞表型及功能的變化,或許能為糖尿病腎病蛋白尿的臨床治療提供借鑒。將實(shí)驗(yàn)分為正常糖對(duì)照組(5.6mmol/L Glu),正常糖+LiCl組,高糖組(25mmol/L Glu)、高糖+LiCl組,檢測(cè)各組足細(xì)胞標(biāo)記蛋白nephrin,podocin,間充質(zhì)標(biāo)記蛋白a-SMA,Fibronectin的表達(dá)量,并應(yīng)用Transwell檢測(cè)各組足細(xì)胞的白蛋白流入量,觀察單層屏障功能的變化。 結(jié)果 1.(1) Western-blot與間接免疫熒光結(jié)果均顯示：與高糖組相比,正常糖對(duì)照組和高滲對(duì)照組足細(xì)胞高表達(dá)nephrin,podocin,僅少量表達(dá)間充質(zhì)蛋白標(biāo)記物a-SMA,Fibronectin;對(duì)Western-blot結(jié)果進(jìn)行灰度分析,發(fā)現(xiàn)nephrin,podocin的蛋白表達(dá)水平隨葡萄糖濃度的升高呈劑量依賴性下調(diào)(p0.05), a-SMA的表達(dá)水平隨葡萄糖濃度的升高呈劑量依賴性上調(diào)(P＜0.05)；(2)用Transwell測(cè)不同處理的足細(xì)胞白蛋白流入量,評(píng)估足細(xì)胞的單層屏障功能,發(fā)現(xiàn)與正常糖濃度組相比,高糖組白蛋白流入量增加,且隨葡萄糖濃度的升高呈計(jì)量依賴性上調(diào)(P＜0.05)。 2.(1) Western-blot結(jié)果顯示,與正常糖及高滲對(duì)照組相比,高糖組足細(xì)胞GSK-3β表達(dá)量增多,pSer9GSK-3β表達(dá)量減少,pTyr216GSK-3β表達(dá)量增多,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);(2) GSK-3β激酶活性檢測(cè)試劑盒顯示,與正常糖相比,經(jīng)高糖處理的足細(xì)胞GSK-3p活性增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 3.應(yīng)用GSK-3βsiRNA處理足細(xì)胞發(fā)現(xiàn),應(yīng)用GSK-3βsiRNA處理組與陰性對(duì)照組及高糖對(duì)照組相比,足細(xì)胞表面標(biāo)記蛋白nephrin,podocin表達(dá)量增多,間充質(zhì)標(biāo)記蛋白a-SMA表達(dá)減少；用Transwell檢測(cè)各組白蛋白流入量,發(fā)現(xiàn)處理組白蛋白流入量減少,單層屏障功能改善。 4.高糖環(huán)境下,應(yīng)用GSK-3β活性抑制劑LiCl可以部分逆轉(zhuǎn)足細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化,改善足細(xì)胞的單層屏障功能。 結(jié)論 1.足細(xì)胞在高糖環(huán)境下發(fā)生轉(zhuǎn)分化(表型改變與功能受損)。 2. GSK-3β參與高糖環(huán)境下足細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化。 3. GSK-3β抑制劑氯化鋰可以一定程度逆轉(zhuǎn)足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化,改善足細(xì)胞單層屏障功能。
【關(guān)鍵詞】：足細(xì)胞 糖原合成酶激酶3β 上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化 轉(zhuǎn)染
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R587.2;R692;R329
【目錄】：

• 摘要4-8
• Abstract8-13
• 目錄13-14
• 主要符號(hào)和縮略語(yǔ)說明14-15
• 前言15-17
• 材料與方法17-28
• 結(jié)果28-36
• 討論36-39
• 結(jié)論39-40
• 參考文獻(xiàn)40-42
• 綜述42-57
• 參考文獻(xiàn)53-57
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷57-58
• 致謝58

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 李金紅;陶建瓴;李航;;足細(xì)胞損傷與糖尿病腎病的研究現(xiàn)狀[J];中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào);2010年05期

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 楊俊;糖原合酶激酶3β調(diào)控前列腺癌細(xì)胞死亡的機(jī)制研究[D];華中科技大學(xué);2010年

  本文關(guān)鍵詞：GSK-3β在高糖環(huán)境下足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化效應(yīng)中的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：383900