p300/CBP及其相關因子PCAF (p300/CBP associated factor,也被稱為KAT2B)有乙酰轉(zhuǎn)移酶活性,能通過乙�；M蛋白和一些非組蛋白成分的方式參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。與大多數(shù)典型的轉(zhuǎn)錄輔激活因子相同,它們能在轉(zhuǎn)錄因子和基本轉(zhuǎn)錄復合物之間起到連接作用。p300/CBP、PCAF與細胞周期調(diào)控、細胞凋亡以及癌癥的發(fā)生、發(fā)展等過程之間有著直接的聯(lián)系。 Marmorstein等人已經(jīng)獲得的PCAF的HAT結(jié)構(gòu)。在本論文中,我們發(fā)現(xiàn)PCAF HAT結(jié)構(gòu)域可通過四個螺旋的疏水性相互作用和B折疊延伸形成二聚體結(jié)構(gòu)。DSS實驗發(fā)現(xiàn)對相互作用面上關鍵氨基酸殘基進行定點突變,這些突變體形成二聚化能力減弱,說明這些氨基酸殘基對HAT二聚化的形成起關鍵作用。pulldown、靜態(tài)光散射和動態(tài)光散射等實驗證實在溶液中HAT以二聚體形式存在,且高濃度狀態(tài)下才能檢測到二聚體。與野生型HAT相比,HAT突變體的乙酰轉(zhuǎn)移酶活性發(fā)生變化,這說明PCAF的二聚化對其乙酰轉(zhuǎn)移酶活性起到調(diào)節(jié)作用�？傊�,一系列實驗證明獲得的PCAF HAT在溶液中主要以單體形式存在,少數(shù)以二聚體形式存在。 腺病毒E1...

【文章頁數(shù)】：135 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
目錄
Table of Contents
第一章 前言
    1.1 組蛋白修飾
    1.2 組蛋白乙�；D(zhuǎn)移酶
        1.2.1 組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶的分類
        1.2.2 p300/CBP
        1.2.3 PCAF
        1.2.4 Gcn5
    1.3 核小體乙�；笍秃衔�
        1.3.1 SAGA復合物
        1.3.2 PCAF復合物
    1.4 組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶功能的研究進展
        1.4.1 組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控
        1.4.2 組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶與細胞周期
        1.4.3 組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶與疾病
            1.4.3.1 組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶與癌癥
            1.4.3.2 組蛋白乙酚轉(zhuǎn)移酶與神經(jīng)系統(tǒng)疾病
            1.4.3.3 組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶與病毒感染
    1.5 腺病毒E1A的研究進展
        1.5.1 E1A的結(jié)構(gòu)及生物學特性
        1.5.2 E1A與p300/CBP、PCAF的關系
        1.5.3 E1A的生物學功能
            1.5.3.1 E1A與細胞周期的關系
            1.5.3.2 E1A與免疫系統(tǒng)的關系
            1.5.3.3 E1A與細胞癌變的關系
    1.6 本文的研究內(nèi)容及意義
第二章 材料與方法
    2.1 材料與試劑
        2.1.1 基因
        2.1.2 質(zhì)粒、菌株
        2.1.3 工具酶和抗體
        2.1.4 人工合成多肽
        2.1.5 試劑
        2.1.6 實驗主要儀器
    2.2 方法
        2.2.1 大腸桿菌(E.coli)感受態(tài)細胞的制備和DNA轉(zhuǎn)化
            2.2.1.1 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備
            2.2.1.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞
        2.2.2 質(zhì)粒DNA的提取
        2.2.3 質(zhì)粒DNA的工具酶處理
            2.2.3.1 DNA的限制性內(nèi)切酶消化
            2.2.3.2 線性DNA 5’端磷酸基團的去除
            2.2.3.3 粘性末端連接
        2.2.4 DNA的純化
            2.2.4.1 聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳
            2.2.4.2 DNA片段回收
        2.2.5 PCR相關實驗
            2.2.5.1 PCR反應
            2.2.5.2 PCR產(chǎn)物的克隆
            2.2.5.3 定點突變
                2.2.5.3.1 定點突變引物
                2.2.5.3.2 定點突變流程
        2.2.6 重組融合蛋白的表達
        2.2.7 蛋白的分離純化
            2.2.7.1 蛋白質(zhì)的分離純化方法及其原理
            2.2.7.2 菌體細胞超聲破碎
            2.2.7.3 親和層析
            2.2.7.4 陽離子交換層析
            2.2.7.5 凝膠過濾層析
        2.2.8 hPCAF(493-658)蛋白突變體的表達質(zhì)粒構(gòu)建、表達和純化
        2.2.9 SDS-PAGE電泳
            2.2.9.1 分離膠及濃縮膠的制備
            2.2.9.2 SDS-PAGE電泳及考馬斯亮藍染色
        2.2.10 Western blot檢測體外乙�；磻�
        2.2.11 組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性測定
        2.2.12 化學交聯(lián)反應
        2.2.13 動態(tài)光散射實驗
        2.2.14 靜態(tài)激光光散射實驗
        2.2.15 pull-down實驗
        2.2.16 蛋白質(zhì)晶體生長
第三章 結(jié)果與分析
    3.1 人PCAF組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性區(qū)域(HAT)的同源二聚體結(jié)構(gòu)研究
        3.1.1 PCAF(493-658)融合蛋白表達質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.1.2 PCAF(493-658)蛋白的表達和純化
        3.1.3 PCAF(493-658)蛋白的晶體篩選、衍射數(shù)據(jù)收集及解析
        3.1.4 PCAF(493-658)蛋白的整體結(jié)構(gòu)
        3.1.5 溶液中PCAF(493-658)蛋白的二聚化
        3.1.6 PCAF(493-658)蛋白二聚化對其乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的影響
        3.1.7 PCAF乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的自我抑制
        3.1.8 小結(jié)
    3.2 hPCAF HAT和E1A復合體
        3.2.1 腺病毒的E1A片段的表達質(zhì)粒構(gòu)建
        3.2.2 PCAF HAT和E1A的相互作用
        3.2.3 E1A對PCAF乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的影響
        3.2.4 PCAF HAT和E1A復合體的晶體篩選
        3.2.5 小結(jié)
    3.3 p300和E1A復合體
        3.3.1 p300蛋白的表達質(zhì)粒構(gòu)建、表達和純化
        3.3.2 p300與E1A的相互作用
        3.3.3 p300與E1A復合體的純化
        3.3.4 p300與E1A復合體的晶體初篩
        3.3.5 小結(jié)
    3.4 討論
附錄1 圖表索引
附錄2 縮略語及中英文對照
參考文獻
致謝



本文編號：3777314