本文關鍵詞：OX1R和KOR異源二聚化對細胞內(nèi)信號轉導途徑的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：食欲素（Orexin，OX）/食欲素受體（Orexin receptor，OXR）系統(tǒng)和強啡肽/κ型阿片肽受體系統(tǒng)在獎賞通路的調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用，與抑郁癥的發(fā)病機制和病理生理過程密切相關。食欲素1型受體(OX1R)和κ型阿片肽受體（KOR）都是G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）超家族A類亞家族的成員。關于二者異源二聚化的研究，到目前為止尚未見報道。本實驗主要觀察OX1R和KOR能否形成異源二聚體以及二聚體形成后對細胞內(nèi)信號轉導途徑的影響，為進一步分析OX1R和KOR參與的包括抑郁癥在內(nèi)的多種疾病的作用機制提供實驗依據(jù)并為相關疾病的治療提供新的作用靶點。 我們首先利用分子克隆的方法成功構建真核重組質粒EGFP-OX1R。利用激光共聚焦顯微鏡下觀察EGFP-OX1R瞬時轉染HEK293細胞后的表達。然后進行免疫熒光染色后在激光共聚焦顯微鏡下觀察瞬時共轉染OX1R-EGFP和KOR-Myc的HEK293細胞，OX1R和KOR在細胞膜的共定位表達。利用生物共振能量轉移技術（bioluminesence resonanceenergy transfer，BRET）檢測OX1R和KOR的異源二聚化。最后建立單獨或共表達OX1R和KOR的穩(wěn)轉細胞系，通過雙熒光素酶法檢測在OrexinA或DynA(1-13)處理下HEK293-OX1R、HEK293-KOR和HEK293-OX1R/KOR細胞內(nèi)的報告基因血清反應元件（SRE）、cAMP反應元件（CRE）、激活T細胞的細胞核因子（NFAT）的表達。Western blot法檢測在OrexinA或DynA(1-13)刺激下cAMP反應元件鏈接蛋白（cAMP response elementbinding protein，CREB）在HEK293-OX1R、HEK293-KOR和HEK293-OX1R/KOR細胞內(nèi)的磷酸化活性變化。OrexinA或DynA(1-13)處理HEK293-OX1R、HEK293-KOR和HEK293-OX1R/KOR細胞后，檢測細胞內(nèi)cAMP的變化。Fluo-4NW試劑盒檢測OrexinA或DynA(1-13)誘導HEK293-OX1R、HEK293-KOR和HEK293-OX1R/KOR細胞質內(nèi)Ca2+含量的變化。我們通過對CRE、SRE、NFAT、cAMP和Ca2+在細胞內(nèi)含量的變化以及對細胞內(nèi)CREB磷酸化活性的檢測探究OX1R和KOR發(fā)生異源二聚化后對細胞內(nèi)信號轉導途徑的影響。 結果顯示，EGFP-OX1R重組質粒構建正確，并且能夠在細胞膜上正確表達；在激光共聚焦顯微鏡下我們觀察到OX1R和KOR能夠同時在細胞膜上表達，表明二者存在發(fā)生相互作用的空間基礎；BRET實驗證明OX1R和KOR能夠形成組成型的二聚體，并證明在orexinA和DynA(1-13)的作用下OX1R和KOR之間的親和力增強，OX1R和KOR形成二聚體的能力增加，引起B(yǎng)RET信號的增強；在穩(wěn)轉細胞系HEK293-OX1R、HEK293-KOR和HEK293-OX1R/KOR細胞內(nèi)瞬時轉染CRE-luc、SRE-luc或NFAT-luc，48小時后在相應激動劑的作用下檢測CRE、SRE或NFAT的表達，結果顯示，與OX1R或KOR單轉細胞相比，OX1R和KOR共轉細胞內(nèi)CRE的表達增加，而SRE和NFAT的表達降低，說明OX1R和KOR形成二聚體后與Gαi和Gαq亞型的G蛋白結合減少而與Gαs亞型的G蛋白結合增加；Western blot檢測濃度和時間依賴性CREB磷酸化活性實驗結果表明，與OrexinA刺激的HEK293-OX1R細胞和DynA(1-13)刺激的HEK293-KOR細胞相比，HEK293-OX1R/KOR細胞在OrexinA或DynA(1-13)的作用下，從2.5min到40min，CREB磷酸化均增強，且HEK293-OX1R/KOR細胞內(nèi)CREB的磷酸化活性在2.5min時達到峰值；濃度依賴的CREB磷酸化檢測結果表明，從10Nm~100nM，OrexinA或DynA(1-13)處理的HEK293-OX1R/KOR細胞內(nèi)CREB的磷酸化活性要比OrexinA刺激的HEK293-OX1R細胞和DynA(1-13)刺激的HEK293-KOR細胞內(nèi)的磷酸化活性明顯增加，表明OX1R/KOR二聚化后與Gαs亞型的G蛋白結合增加，增強了細胞內(nèi)CREB的磷酸化；細胞內(nèi)鈣離子含量的檢測結果表明，HEK293-OX1R/KOR細胞在OrexinA或DynA(1-13)的作用下，細胞內(nèi)的鈣離子含量比OrexinA刺激的HEK293-OX1R細胞內(nèi)的含量降低，進一步表明OX1R/KOR二聚體與Gαq亞型的G蛋白結合降低；同理，在對細胞內(nèi)cAMP含量的檢測實驗中我們看到OrexinA或DynA(1-13)處理的HEK293-OX1R/KOR細胞內(nèi)cAMP的含量也明顯比DynA(1-13)處理的HEK293-KOR細胞內(nèi)的含量增加，表明OX1R/KOR二聚體與Gαi亞型的G蛋白結合降低，與Gαs亞型的G蛋白結合增加。 本研究發(fā)現(xiàn)在轉染OX1R和KOR的HEK293細胞內(nèi)，OX1R和KOR能夠形成穩(wěn)定的異源二聚體，在食欲素或強啡肽作用下OX1R/KOR二聚體改變了原有單體的信號轉導通路，，使OX1R/KOR二聚體與Gαi和Gαq亞型的G蛋白結合減少而與Gαs亞型的G蛋白結合增加，細胞內(nèi)信號轉導通路向AC/PKA發(fā)生偏轉，使細胞內(nèi)CREB的磷酸化活性增加。CREB的活性與抑郁癥的發(fā)生密切相關，在抑郁癥的發(fā)病機制和治療的研究中占有重要地位。因此，對OX1R和KOR異源二聚化的研究為深入研究OX1R和KOR與抑郁癥的關系提供了新的實驗依據(jù)，為臨床上抑郁癥的治療提供了新的思路，為抗抑郁新藥的研發(fā)提供了新的藥物靶點，具有重要的現(xiàn)實意義和應用推廣價值。
【關鍵詞】：食欲素1型受體 κ型阿片肽受體 G蛋白偶聯(lián)受體 異源二聚化 信號轉導
【學位授予單位】：曲阜師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R3416;Q78
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-9
• 中英文符號對照表9-10
• 一 前言10-14
• 二 材料和方法14-27
• （一） 實驗材料14-17
• 1 質粒、細菌和菌株14
• 2 抗體14
• 3 生化試劑及試劑盒14-15
• 4 主要實驗儀器15-16
• 5 主要試劑的配制方法16-17
• （二） 實驗方法17-27
• 1 表達載體的構建17-19
• 2 穩(wěn)轉細胞的篩選和鑒定19-20
• 3 激光共聚焦顯微鏡檢測 OX1R 和 KOR 的共定位表達20
• 4 BRET 技術檢測 OX1R 和 KOR 之間的關系20-21
• 5 雙熒光素酶法檢測細胞內(nèi)報告基因 SRE、CRE 和 NFAT 的含量21-22
• 6 細胞內(nèi)鈣離子含量的檢測22-23
• 7 ELISA 法檢測細胞內(nèi) cAMP 的含量23-24
• 8 Western Blot 檢測 OX1R/KOR 異源二聚體對 CREB 磷酸化的影響24-27
• 三 實驗結果27-38
• （一） EGFP-OX1R 重組融合載體的構建和表達27
• （二） 穩(wěn)轉細胞的鑒定27-28
• （三） 激光共聚焦顯微鏡檢測 OX1R 和 KOR 的共定位表達28-29
• （四） BRET 檢測 OX1R 和 KOR 之間的異源二聚化29-31
• （五） 雙熒光素酶法檢測細胞內(nèi)報告基因 CRE、SRE 和 NFAT 的含量31-33
• （六） 細胞內(nèi)鈣離子含量的測定33-34
• （七） 細胞內(nèi) cAMP 含量的檢測34-35
• （八） Western blot 檢測 OX1R/KOR 異源二聚體使 CREB 活性增強35-38
• 四 討論38-40
• 五 結論40-41
• 參考文獻41-45
• 綜述45-50
• 參考文獻47-50
• 已發(fā)表文章50-51
• 致謝51

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 李聰慧;楊世平;閻鳳芝;;首次住院抑郁癥患者就診途徑調(diào)查分析[J];中國全科醫(yī)學;2006年11期

  本文關鍵詞：OX1R和KOR異源二聚化對細胞內(nèi)信號轉導途徑的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：375979