目的建立人骨靶向干擾素γ-1b的高效原核表達(dá)體系。方法從Drug Bank數(shù)據(jù)庫下載人干擾素γ-1b氨基酸序列,在羧基端加上10個天冬氨酸標(biāo)簽作為骨靶向分子。采用大腸桿菌偏愛密碼子,DNA Star軟件分析獲得骨靶向性干擾素γ-1b的基因序列。人工合成基因序列并克隆入pET3c質(zhì)粒表達(dá)載體。將上述pET3c-rhIFNγ-1b-D10重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21,篩選高效表達(dá)菌株。分離包涵體,8mol/L尿素溶解,利用鎳柱親和層析純化重組蛋白。Western blot檢測目的蛋白的特異性表達(dá)。結(jié)果測序結(jié)果顯示所克隆的骨靶向rhIFNγ-1b基因序列正確,篩選出高效表達(dá)菌株。經(jīng)SDS-PAGE顯示在相對分子質(zhì)量19KD處出現(xiàn)特異的目的蛋白表達(dá)帶,表達(dá)量約占全菌蛋白的30%。表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在,8mol/L尿素變性后經(jīng)鎳柱親和層析純化,純度大于90%,濃度為0.8mg/mL。Western檢測顯示在19KD處出現(xiàn)特異性目的條帶。結(jié)論成功在大腸桿菌中表達(dá)了人骨靶向干擾素γ-1b,為研究其生物學(xué)活性及用于骨硬化癥的治療奠定基礎(chǔ)。

【文章頁數(shù)】：3 頁

【文章目錄】：
1--材料與方法
    1.1 大腸桿菌DH5α、BL21、質(zhì)粒pET3c由本室保存。
    1.2 rhIFNγ-1b-D10重組表達(dá)載體的構(gòu)建
    1.3 骨靶向重組人干擾素γ-1b (rhIFNγ-1b-D10) 在大腸桿菌中的表達(dá)
    1.4 目的蛋白的Western blot檢測
    1.5 目的蛋白表達(dá)形式分析
    1.6 目的蛋白的鎳柱親和層析純化
2--結(jié)---果
    2.1 骨靶向重組人干擾素γ-1b (rhIFNγ-1b-D10) 的表達(dá)與鑒定
    2.2 rhIFNγ-1b-D10蛋白表達(dá)形式的確定
    2.3 包涵體分離及純化
3--討---論



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