本文關鍵詞：斑馬魚redd1基因在心臟左右不對稱發(fā)育中功能的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：REDD1(Regulated in Development and DNA Damage response1)屬于DDIT（DNA Damage Inducible Transcript）蛋白家族。目前認為這一家族成員參與生長發(fā)育、DNA損傷修復、細胞凋亡、炎癥反應、壓力應激、腫瘤的發(fā)生發(fā)展等生理病理過程。REDD1受缺氧、氧化應激、饑餓等應激狀態(tài)所調控，通過抑制mTOR信號通路來發(fā)揮作用。REDD1功能異�？蓪е屡两鹕�、腫瘤和骨骼肌萎縮等疾病。而且，關于REDD1的表達模式以及其在生理和病理過程中的作用大多來自體外細胞系的結果，對于其體內時空表達方式及其基因調控方式，尤其是體內基因敲降后的表型研究還相對較少。 最近在斑馬魚研究中發(fā)現(xiàn)Redd1在β-Catenin水平上拮抗經(jīng)典Wnt信號通路，調節(jié)脊椎動物胚胎的背腹軸發(fā)育。RT-PCR檢測斑馬魚不同發(fā)育時期胚胎發(fā)現(xiàn)，redd1基因在整個胚胎發(fā)育時期均有表達。整胚原位雜交方法檢測redd1的空間表達方式發(fā)現(xiàn)，redd1mRNA在50%外包時期（6hpf），主要集中在胚環(huán)區(qū)域，即中胚層前體細胞存在區(qū)域。在體節(jié)形成和隨后的發(fā)育過程中，主要集中在前脊索神經(jīng)板、頭部外胚層和尾部中胚層等部位。 本課題通過進一步研究，發(fā)現(xiàn)在斑馬魚體節(jié)形成時期，redd1mRNA在尾部中胚層表達區(qū)域與Kupffer’s囊泡位置重合或者部分重合。我們猜測redd1可能參與胚胎左右不對稱發(fā)育的調控，并且至今未有相關報道，因此我們研究redd1在胚胎左右不對稱發(fā)育中的作用，對于發(fā)現(xiàn)redd1在胚胎發(fā)育方面的新作用具有重要的意義。 在我們的研究工作中，通過在1-cell時期注射morpholino抑制redd1表達會導致早期的左右不對稱的標志性基因southpaw，lefty2和后期的內部器官的標志性基因cmlc2表達出現(xiàn)隨機分布，并造成lefty1在胚胎中線的表達部分缺失但對foxa3表達無明顯影響。在中囊胚時期敲降胚胎背部前驅細胞redd1，表型與1-cell時期敲降一致，并且造成Kupffer’s囊泡變小，泡內的單纖毛數(shù)目變少，長度變短，同時伴隨轉錄因子foxj1a、 sox17在背部前驅細胞表達減弱。 本實驗首次發(fā)現(xiàn)了斑馬魚redd1調控胚胎的左右不對稱發(fā)育。redd1下調了轉錄因子foxj1a、sox17的表達水平，影響了kupffer’s囊泡和cilia的形成。導致與Nodal信號通路開啟相關的標志性基因southpaw、lefty2、lefty1在胚胎側板中胚層及胚胎中線的表達異常，進而影響了心臟的發(fā)育。
【關鍵詞】：左右不對稱發(fā)育 Kupffer’s囊泡(KV) 側板中胚層(LPM) redd1 BMP 斑馬魚
【學位授予單位】：中國海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R321
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-11
• 1 引言11-29
• 1.1 斑馬魚11-13
• 1.2 斑馬魚胚胎的左右不對稱發(fā)育13-17
• 1.2.1 脊椎動物的左右不對稱發(fā)育13-14
• 1.2.2 斑馬魚左右不對稱發(fā)育軸的形成14-15
• 1.2.3 斑馬魚 Kupffer’s 囊泡（KV）的形成15-17
• 1.3 REDD117-25
• 1.3.1 REDD1 的來歷17
• 1.3.2 REDD1 的結構17-18
• 1.3.3 REDD1 的表達18-19
• 1.3.4 REDD1 對細胞的調節(jié)19-20
• 1.3.5 REDD1 的調節(jié)作用20-22
• 1.3.6 REDD1 的生物學和病理學功能22-23
• 1.3.7 REDD1 與胚胎發(fā)育23-25
• 1.4 展望25-26
• 1.5 立題依據(jù)及研究意義26-29
• 2 斑馬魚 redd1 基因在心臟左右不對稱發(fā)育中功能的初步研究29-67
• 2.1 前言29-30
• 2.2 實驗材料與方法30-43
• 2.2.1 實驗試劑30-31
• 2.2.2 實驗用魚31
• 2.2.3 儀器設備31-32
• 2.2.4 斑馬魚的飼養(yǎng)與胚胎獲取32
• 2.2.5 去除胚胎卵膜32
• 2.2.6 顯微注射32-33
• 2.2.7 質粒的提取與純化33
• 2.2.8 提取總 RNA33-34
• 2.2.9 總 RNA 反轉錄成 cDNA34-35
• 2.2.10 RNA 的體外合成35-36
• 2.2.11 整胚原位雜交36-41
• 2.2.12 探針點雜交（dot-blot）41
• 2.2.13 免疫組織化學41-42
• 2.2.15 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析42-43
• 2.3 實驗結果43-63
• 2.3.1 斑馬魚 redd1 在胚胎早期發(fā)育的表達譜43-44
• 2.3.2 斑馬魚 redd1 與 charon 基因的共定位44
• 2.3.3 抑制斑馬魚中 redd1 的表達，影響心臟的不對稱分布44-48
• 2.3.4 抑制斑馬魚中 redd1 的表達，影響胚胎早期的左右不對稱發(fā)育48-52
• 2.3.5 redd1 以細胞自主調節(jié)的方式調控左右不對稱發(fā)育52-55
• 2.3.6 中囊胚敲降 redd1 后，影響 Kupffer’s 囊泡及 cilia 形成55-59
• 2.3.7 中囊胚敲降 redd1 后，，影響轉錄因子 foxj1a、sox17 表達59-62
• 2.3.8 中囊胚敲降 redd1 后，影響 bmp4 表達62-63
• 2.4 討論63-67
• 3 總結67-70
• 4 展望70-72
• 參考文獻72-79
• 致謝79-80
• 個人簡歷80-81
• 碩士期間發(fā)表與撰寫的文章81-82

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本文編號：373521