發(fā)布時(shí)間：2017-05-16 07:05

  本文關(guān)鍵詞：FGF-21在抵抗素引發(fā)胰島素抵抗的肝細(xì)胞模型中的糖代謝作用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：隨著人們生活水平的不斷提高,糖尿病逐漸發(fā)展成為全球性疾病,嚴(yán)重影響人類健康。胰島素抵抗是指機(jī)體對(duì)胰島素敏感性降低,是2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制,與多種代謝異常有關(guān)。肝臟作為人體內(nèi)重要的血糖調(diào)控器官,也是發(fā)生胰島素抵抗的主要器官。解決胰島素抵抗時(shí)期機(jī)體的糖代謝紊亂一直是糖尿病研究的熱點(diǎn)。但胰島素抵抗的具體誘導(dǎo)因素與發(fā)病機(jī)制還不是很清楚,抵抗素是2001年Steppan等發(fā)現(xiàn)的一種與胰島素抵抗有密切聯(lián)系的細(xì)胞因子,研究表明,抵抗素作用于肝臟,促進(jìn)糖異生關(guān)鍵酶表達(dá)和肝糖原分解,使肝糖輸出增加,從而參與肝臟胰島素抵抗的形成,進(jìn)而進(jìn)一步削弱胰島素對(duì)機(jī)體血糖的調(diào)控能力。FGF-21是人體內(nèi)一個(gè)重要的糖代謝調(diào)節(jié)因子,肝臟是FGF-21發(fā)揮生物學(xué)活性的重要靶器官,高濃度胰島素刺激而導(dǎo)致的胰島素抵抗的細(xì)胞仍能對(duì)FGF-21做出有效應(yīng)答,FGF21在抵抗素引起的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下是否仍然具有調(diào)節(jié)糖代謝作用尚無報(bào)道。 本研究的目的是通過構(gòu)建過表達(dá)人抵抗素的胰島素抵抗肝細(xì)胞模型,檢測(cè)FGF-21在抵抗素過表達(dá)引發(fā)胰島素抵抗的肝細(xì)胞中的糖代謝作用。本研究構(gòu)建人抵抗素真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,利用流式細(xì)胞儀篩選出過表達(dá)抵抗素的HepG2模型細(xì)胞,分別用不同濃度的胰島素和FGF-21刺激細(xì)胞,用GOD-POD法檢測(cè)細(xì)胞的葡萄糖攝取情況,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)抵抗素轉(zhuǎn)染后及FGF-21處理后細(xì)胞GLUT1、PPAR-γmRNA表達(dá)的變化。利用蒽酮法檢測(cè)FGF-21處理后細(xì)胞的糖原合成量變化。 本研究成功構(gòu)建過表達(dá)抵抗素的HepG2模型細(xì)胞,GOD-POD法檢測(cè)結(jié)果顯示,模型細(xì)胞經(jīng)不同濃度胰島素刺激后,葡萄糖消耗增加比率顯著低于對(duì)照組,說明模型細(xì)胞對(duì)胰島素敏感性降低,產(chǎn)生胰島素抵抗,但經(jīng)不同濃度FGF-21刺激后,模型細(xì)胞的葡萄糖消耗增加比率與對(duì)照組無差異,且葡萄糖消耗比率與FGF-21呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系,此結(jié)果說明FGF-21可有效調(diào)節(jié)胰島素抵抗模型細(xì)胞的葡萄糖攝取；實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),抵抗素轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞GLUT1mRNA表達(dá)增加,經(jīng)FGF-21刺激后模型細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞相比GLUT1mRNA的表達(dá)仍有上升趨勢(shì),PPAR-γ的變化不顯著,結(jié)果表明FGF-21能有效調(diào)節(jié)過表達(dá)抵抗素引發(fā)胰島素抵抗模型細(xì)胞GLUT1表達(dá)量,從而促進(jìn)細(xì)胞攝取葡萄糖,有效調(diào)節(jié)細(xì)胞的葡萄糖代謝；利用蒽酮法檢測(cè)糖原合成量,結(jié)果表明模型細(xì)胞的糖原合成量顯著低于對(duì)照組,但經(jīng)不同濃度FGF-21刺激后,糖原合成含量提高,且與FGF-21含量成劑量依賴關(guān)系,實(shí)驗(yàn)證明FGF-21可增加模型細(xì)胞內(nèi)糖原含量,從而促進(jìn)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用消耗。 綜上所述,本研究證明抵抗素過表達(dá)的肝細(xì)胞,對(duì)胰島素敏感性降低,產(chǎn)生胰島素抵抗,但FGF-21仍能有效調(diào)節(jié)其葡萄糖代謝。
【關(guān)鍵詞】：抵抗素 FGF-21 胰島素抵抗 HepG2
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R3411
【目錄】：

• 目錄3-6
• CONTENTS6-10
• 摘要10-11
• Abstract11-13
• 1 前言13-17
• 1.1 抵抗素的簡(jiǎn)介13-14
• 1.1.1 抵抗素的概述13
• 1.1.2 人抵抗素的分子結(jié)構(gòu)特征13
• 1.1.3 人抵抗素的表達(dá)與分布13-14
• 1.1.4 抵抗素與胰島素抵抗的關(guān)系14
• 1.2 FGF-21的簡(jiǎn)介14-16
• 1.2.1 FGF-21的概述14-15
• 1.2.2 FGF-21生物學(xué)功能15-16
• 1.2.3 FGF-21的安全性16
• 1.3 研究目的與意義16-17
• 2 實(shí)驗(yàn)材料17-20
• 2.1 質(zhì)粒和細(xì)胞株17
• 2.2 培養(yǎng)基及試劑17
• 2.3 Overlap PCR引物17-18
• 2.4 Real-time PCR引物及試劑盒18
• 2.5 主要儀器設(shè)備18-20
• 3 方法20-34
• 3.1 Resistin基因定點(diǎn)突變20-24
• 3.1.1 Resistin基因A段PCR擴(kuò)增及膠回收20-21
• 3.1.2 Resistin基因B段PCR擴(kuò)增及膠回收21
• 3.1.3 Resistin基因Overlap PCR擴(kuò)增及膠回收21-22
• 3.1.4 Resistin Overlap PCR純化產(chǎn)物與T載體的連接22
• 3.1.5 大腸桿菌E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備22
• 3.1.6 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化及質(zhì)粒提取22-23
• 3.1.7 陽性重組質(zhì)粒的鑒定23
• 3.1.8 Resistin基因定點(diǎn)突變后的序列測(cè)定及分析23-24
• 3.2 Resistin真核表達(dá)載體的構(gòu)建24-27
• 3.2.1 Peedual-Resistin真核表達(dá)載體設(shè)計(jì)方案24-25
• 3.2.2 Pkappa-Resistin重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定25
• 3.2.3 Pee12.4-Resistin重組載體的構(gòu)建及鑒定25-26
• 3.2.4 Peedual-Resistin真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定26-27
• 3.2.5 peedual對(duì)照載體構(gòu)建及鑒定27
• 3.2.6 去內(nèi)毒素的質(zhì)粒提取及濃度測(cè)定27
• 3.3 過表達(dá)抵抗素模型細(xì)胞的建立27-31
• 3.3.1 HepG2細(xì)胞培養(yǎng)27-28
• 3.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染28
• 3.3.3 陽性細(xì)胞的篩選28-29
• 3.3.4 過表達(dá)抵抗素細(xì)胞系HepG2-R的鑒定29-31
• 3.4 過表達(dá)抵抗素細(xì)胞系HepG2-R糖代謝的研究31-34
• 3.4.1 MTT法檢測(cè)Resistin基因轉(zhuǎn)染對(duì)HepG2細(xì)胞增殖活力的影響31
• 3.4.2 過表達(dá)抵抗素細(xì)胞系HepG2-R基礎(chǔ)糖吸收的檢測(cè)31
• 3.4.3 過表達(dá)抵抗素細(xì)胞系HepG2-R對(duì)胰島素敏感性的檢測(cè)31-32
• 3.4.4 FGF-21對(duì)過表達(dá)抵抗素細(xì)胞系HepG2-R糖吸收的影響32
• 3.4.5 Resistin基因轉(zhuǎn)染對(duì)HepG2細(xì)胞GLUT1、PPAR-γ表達(dá)的影響32
• 3.4.6 FGF-21對(duì)HepG2-R的GLUT1、PPAR-γ表達(dá)的影響32-33
• 3.4.7 Resistin基因轉(zhuǎn)染對(duì)HepG2細(xì)胞糖原合成的影響33
• 3.4.8 FGF-21對(duì)HepG2-R糖原合成的影響33-34
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果34-53
• 4.1 Resistin基因定點(diǎn)點(diǎn)突變34-36
• 4.1.1 Resistin基因A段PCR擴(kuò)增及純化34
• 4.1.2 Resistin基因B段PCR擴(kuò)增及純化34-35
• 4.1.3 Resistin基因Overlap PCR擴(kuò)增及純化35-36
• 4.1.4 pMD18-T-Resistin重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定36
• 4.2 Resistin真核表達(dá)載體的構(gòu)建36-40
• 4.2.1 Pkappa-Resistin質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定36-37
• 4.2.2 Pee12.4-Resistin重組載體的構(gòu)建及鑒定37-38
• 4.2.3 Peedual-Resistin真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定38-40
• 4.2.4 peedual對(duì)照載體構(gòu)建40
• 4.2.5 去內(nèi)毒素的質(zhì)粒提取及濃度測(cè)定40
• 4.3 過表達(dá)抵抗素細(xì)胞系HepG2-R建立40-44
• 4.3.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染40-41
• 4.3.2 陽性細(xì)胞的篩選41-43
• 4.3.3 過表達(dá)抵抗素細(xì)胞系HepG2-R的鑒定43-44
• 4.4 FGF-21對(duì)過表達(dá)抵抗素細(xì)胞系HepG2-R糖代謝作用的研究44-53
• 4.4.1 MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響44-45
• 4.4.2 過表達(dá)抵抗素細(xì)胞系HepG2-R基礎(chǔ)糖吸收的檢測(cè)45
• 4.4.3 過表達(dá)抵抗素細(xì)胞系HepG2-R對(duì)胰島素敏感性的檢測(cè)45-46
• 4.4.4 FGF-21對(duì)模型細(xì)胞糖吸收的影響46-47
• 4.4.5 Resistin基因轉(zhuǎn)染對(duì)HepG2細(xì)胞GLUT1、PPAR-γ表達(dá)的影響47-49
• 4.4.6 FGF-21對(duì)模型細(xì)胞GLUT1、PPAR-γ表達(dá)的影響49-50
• 4.4.7 Resistin基因轉(zhuǎn)染對(duì)HepG2細(xì)胞糖原合成的影響50-51
• 4.4.8 FGF-21對(duì)過表達(dá)抵抗素模型細(xì)胞糖原合成的影響51-53
• 5 討論53-56
• 5.1 過表達(dá)抵抗素引發(fā)胰島素抵抗模型細(xì)胞的建立53-54
• 5.2 FGF-21有效調(diào)節(jié)模型細(xì)胞的葡萄糖消耗54
• 5.3 Resistin基因轉(zhuǎn)染對(duì)HepG2細(xì)胞GLUT1、PPAR-γ表達(dá)的影響54-55
• 5.4 FGF-21對(duì)模型細(xì)胞GLUT1、PPAR-γ表達(dá)的影響55
• 5.5 FGF-21調(diào)節(jié)模型細(xì)胞的糖原合成55-56
• 6 結(jié)論56-57
• 致謝57-58
• 參考文獻(xiàn)58-62
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文62

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：FGF-21在抵抗素引發(fā)胰島素抵抗的肝細(xì)胞模型中的糖代謝作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：370137