發(fā)布時(shí)間：2022-10-15 14:29

　　目的建立成年狨猴腎臟細(xì)胞體外培養(yǎng)的培養(yǎng)體系,并將Cas9編輯系統(tǒng)初步應(yīng)用于所培養(yǎng)的狨猴腎臟細(xì)胞,建立檢測(cè)sgRNA切割活性的體系。方法取成年的狨猴腎臟,采用貼壁法、消化法得到狨猴腎臟細(xì)胞。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行生長(zhǎng)曲線測(cè)定、轉(zhuǎn)染試劑（Viafect和Lipo2000）及抗性（嘌呤霉素和殺稻瘟菌素）濃度篩選,將SIRT1的sgRNA質(zhì)粒和Cas9質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染狨猴細(xì)胞,提取基因組并對(duì)基因修飾目的片段擴(kuò)增,并將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果建立狨猴腎臟細(xì)胞體外培養(yǎng)體系;ViaFect轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染率大于60%;細(xì)胞抗性篩選適宜濃度嘌呤霉素4μg/mL,殺稻瘟菌素8μg/mL;測(cè)序結(jié)果表明,從sgRNA的PAM序列附近開(kāi)始出現(xiàn)突變峰,證明sgRNA成功引入突變。結(jié)論成功建立了狨猴腎臟細(xì)胞的體外培養(yǎng)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染和抗性篩選體系;CRISPR/Cas9可以用于狨猴腎臟細(xì)胞編輯,為基因修飾狨猴靶點(diǎn)選擇提供依據(jù)。 

【文章頁(yè)數(shù)】：5 頁(yè)

【文章目錄】：
1 材料和方法
    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
    1.2 主要試劑及儀器
    1.3 實(shí)驗(yàn)方法
        1.3.1 狨猴腎臟原代細(xì)胞培養(yǎng)
        1.3.2 傳代培養(yǎng)
        1.3.3 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定與繪制
        1.3.4 細(xì)胞凍存與復(fù)蘇
        1.3.5 藥物抗性篩選與轉(zhuǎn)染
        1.3.6 CRISPR-Cas9在狨猴原代腎臟細(xì)胞的應(yīng)用研究
    1.4 數(shù)據(jù)與圖片
2 結(jié)果
    2.1 原代腎臟細(xì)胞培養(yǎng)
    2.2 腎臟細(xì)胞培養(yǎng)傳代
    2.3 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定與繪制
    2.4 細(xì)胞凍存與復(fù)蘇
    2.5 藥物抗性篩選與轉(zhuǎn)染
    2.6 CRISPR-Cas9在狨猴細(xì)胞的應(yīng)用研究
3 討論


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]靈長(zhǎng)類動(dòng)物基因編輯技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 康宇,陳永昌,牛昱宇.  生命科學(xué). 2015(01)
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[3]原代肝、腎細(xì)胞培養(yǎng)在保健食品原料毒性篩選中的應(yīng)用[J]. 戴偉,顧光,高芃,徐海濱.  中國(guó)食品衛(wèi)生雜志. 2010(03)
[4]SIRT1與神經(jīng)變性疾病[J]. 王穎,高靜,錢(qián)進(jìn)軍.  生命科學(xué). 2010(04)
[5]大鼠腎細(xì)胞分離制備及培養(yǎng)方法的比較[J]. 顧光,高芃,支媛,殷召雪,隋海霞,劉珊,周宇紅,徐海濱.  衛(wèi)生研究. 2005(05)
[6]腎組織上皮細(xì)胞的培養(yǎng)及其應(yīng)用進(jìn)展[J]. 熊祖應(yīng),梅俏,徐叔云.  中國(guó)藥理學(xué)通報(bào). 1999(04)

博士論文
[1]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建基因編輯猴及CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用優(yōu)化[D]. 崔益強(qiáng).南京醫(yī)科大學(xué) 2017



本文編號(hào)：3691475