本文關(guān)鍵詞：FGF-1-mscFv的人源化改造和可溶性表達(dá)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：單鏈抗體(single chain variable fragment，scFv)是一種小分子基因工程抗體，具有異源性低，分子量小，穿透力強(qiáng)，且易于生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。因此，本實(shí)驗(yàn)室從一株FGF-1特異性的雜交瘤中克隆了抗FGF-1抗體的輕鏈可變區(qū)基因(VL)和重鏈可變區(qū)(VH)基因，并通過Linker將其連接成單鏈抗體FGF-1-mscFv。但是現(xiàn)有研究表明鼠源單鏈抗體在臨床應(yīng)用中會(huì)在人體中產(chǎn)生人抗鼠抗體（humananti-mouse antibody，HAMA）反應(yīng)，這不僅會(huì)降低抗體藥物的療效，同時(shí)強(qiáng)烈的致敏反應(yīng)還產(chǎn)生一定的副作用，因此我們將鼠源的FGF-1-mscFv氨基酸序列進(jìn)行了人源化的改造。首先對(duì)mscFv的氨基酸序列在人源抗體數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，尋找到同源性最高的氨基酸序列作為人源化的框架區(qū)(framework region,FR)模板，然后對(duì)mscFv可變區(qū)按照kabat原則進(jìn)行互補(bǔ)決定區(qū)(complementary-determining region,CDR)序列分析，確定了重鏈和輕鏈各三組的CDR的氨基酸序列。通過固定位置分析法分析了FR中可能對(duì)CDR空間結(jié)構(gòu)有影響的游標(biāo)殘基、特異性殘基、重鏈輕鏈交界面殘基、正則殘基。利用同源建模原理對(duì)mscFv進(jìn)行了三維空間結(jié)構(gòu)建模并分析了空間結(jié)構(gòu)中的包埋殘基、抗原結(jié)合活性位點(diǎn)殘基和CDR鄰近殘基，這些殘基在維持親本抗體抗原結(jié)合活力中可能發(fā)揮作用，，應(yīng)該在人源化序列中保留。接下來又分析了mscFv空間結(jié)構(gòu)中的表面殘基，為了降低人源化抗體的HAMA反應(yīng)，這些殘基應(yīng)該盡量在人源化序列中被替換。結(jié)合mscFv的CDR序列、人源FR模板以及FR模板中需要回變的氨基酸殘基，最終獲得了人源化的hscFv的氨基酸序列以及密碼子優(yōu)化的核苷酸序列，我們將728bp的mscFv和hscFv核苷酸序列重組到了可溶性表達(dá)載體pET22b上分別獲得了重組質(zhì)粒pET22b-mscFv和重組質(zhì)粒pET22b-hscFv。利用優(yōu)化的菌株，載體，溫度，培養(yǎng)基，誘導(dǎo)劑濃度等條件，分別獲得了周質(zhì)腔可溶蛋白mscFv以及hscFv，其中hscFv分子量在30kd左右，并且通過免疫印跡法實(shí)驗(yàn)證明hscFv含有pET22b載體上的His標(biāo)簽，酶聯(lián)免疫吸附ELISA法檢測(cè)證明人源化改造的hscFv仍能和FGF-1結(jié)合。為我們進(jìn)一步研究hscFv在真核細(xì)胞水平上的功能打下了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：單鏈抗體 抗體人源化 CDR移植抗體 可溶性蛋白
【學(xué)位授予單位】：東北師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R392;Q78
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-8
• 1 引言8-14
• 1.1 單克隆抗體在應(yīng)用上存在的問題及解決辦法8-11
• 1.1.1 重組抗體片段8
• 1.1.2 人源化抗體8-11
• 1.2 真核蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)11-13
• 1.3 立題依據(jù)13-14
• 2 材料和方法14-21
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料14
• 2.1.1 質(zhì)粒和菌株14
• 2.1.2 主要試劑14
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法14-21
• 2.2.1 抗 FGF-1-mscFv 的重鏈和輕鏈可變區(qū)的人源化設(shè)計(jì)14-16
• 2.2.2 pET22b-mscFv 表達(dá)載體的構(gòu)建16-17
• 2.2.3 Rosetta 感受態(tài)的制備17
• 2.2.4 鑒定 pET22b-mscFv 基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)17-18
• 2.2.5 pET22b-mscFv 基因在大腸桿菌中周質(zhì)腔的表達(dá)情況檢測(cè)18
• 2.2.6 pET22b-hscFv 基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化18
• 2.2.7 免疫印跡法檢測(cè) pET22b-hscFv 在大腸桿菌周質(zhì)腔中的誘導(dǎo)表達(dá)蛋白18-19
• 2.2.8 ELISA 檢測(cè) hscFv 與 FGF-1 結(jié)合活性19-21
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果21-35
• 3.1 人源化設(shè)計(jì)和氨基酸譯本的確定21-29
• 3.1.1 人源 FR 模板的選擇21-23
• 3.1.2 各個(gè) CDR 區(qū)的確定23-24
• 3.1.3 固定位置法分析框架區(qū)需要保留的鼠源殘基24-25
• 3.1.4 對(duì) mscFv 三維結(jié)構(gòu)同源建模并分析重要的氨基酸殘基25-26
• 3.1.5 氨基酸模板的確定以及密碼子的優(yōu)化26-29
• 3.1.6 人源化改造后的 VH 和 VL 的人源程度評(píng)價(jià)29
• 3.2 pET22b-mscFv 原核表達(dá)載體的構(gòu)建29-30
• 3.3 pET22b-mscFv 基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)30-31
• 3.4 pET22b-hscFv 基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)31-33
• 3.5 免疫印跡法檢測(cè)周質(zhì)腔表達(dá)蛋白與 His 單抗結(jié)合的專一性33-34
• 3.6 ELISA 檢測(cè)周質(zhì)腔可溶蛋白 hscFv 與 FGF-1 結(jié)合活力34-35
• 4 討論35-38
• 5 結(jié)論38-39
• 參考文獻(xiàn)39-42
• 致謝42

【引證文獻(xiàn)】

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 劉豐;人抗乙肝表面抗體在畢赤酵母中的表達(dá)[D];吉林大學(xué);2014年

  本文關(guān)鍵詞：FGF-1-mscFv的人源化改造和可溶性表達(dá)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：369018