本文關鍵詞：miRNAlet-7c在anisomycin誘導JurkatT細胞凋亡中的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景：有文獻報道anisomycin在體外能誘導多種細胞凋亡，本研究組之前的研究證實anisomycin能抑制多種不同組織學類型腫瘤細胞的增殖和誘導Jurkat T細胞的凋亡，并證實JNK （c-jun N-terminal or stress-activated protein kinases）信號通路介導Jurkat T細胞凋亡。目前為止，JNK信號通路下游作用于何種凋亡相關分子及其受哪些miRNA調(diào)控從而介導細胞凋亡尚未見報道。顯然，探明這一點具有重要的科學意義，將有助于揭示anisomycin誘導細胞凋亡的機制以及豐富現(xiàn)有細胞凋亡理論。 目的：初步探討let-7c在anisomycin誘導Jurkat T細胞凋亡中的作用與可能機制。 方法：流式細胞術分析不同濃度anisomycin于6h和24h誘導Jurkat T細胞凋亡以及JNK通路特異性阻斷劑SP600125和ERK（extracellular-signal regulated kinase）通路特異性阻斷劑PD98059的逆轉作用；選擇40ng/ml anisomycin為有效劑量，Western Blot檢測anisomycin對凋亡相關蛋白P-BCL-XL和P-Bim表達水平的影響，并用SP600125和PD98059進行干預；用報告基因array檢測anisomycin處理后Jurkat T細胞凋亡相關轉錄因子的活性；EMSA（electrophoretic mobility shift assay）檢測轉錄因子AP-1的DNA結合活性；利用miRNAarray從48種與細胞凋亡相關的miRNA中篩選anisomycin作用后差異表達的miRNA，再利用qPCR進行驗證。選擇差異表達穩(wěn)定的let-7c進行功能鑒定，轉染let-7c-mimic和let-7c-inhibitor及其突變體，與anisomycin處理組比較，通過qPCR檢測其增減倍數(shù)，并利用流式細胞術及Western Blot分析其在細胞凋亡中的作用。 結果： anisomycin誘導的Jurkat T細胞凋亡呈現(xiàn)濃度依賴性，隨著anisomycin濃度的升高，雙染細胞數(shù)目明顯升高，SP600125可明顯逆轉這種變化，PD98059卻無此作用。與對照組相比，經(jīng)40ng/ml的anisomycin處理后，磷酸化的Bim （P-Bim）和磷酸化的BCL-XL（P-BCL-XL）的蛋白表達量明顯升高，SP600125可致這兩種蛋白的表達量明顯下調(diào)，PD98059卻不能逆轉此變化。轉錄因子AP-1、NF-κb及P53的活性隨anisomycin濃度升高而增強，而轉錄因子HIF、STAT-1及STAT-3的活性卻隨著anisomycin濃度的升高而降低，，轉錄因子ISRE的變化無規(guī)律性。EMSA結果顯示隨著anisomycin濃度的提高，AP-1的DNA結合活性依次增強，可被SP600125所逆轉，與報告基因array中檢測AP-1的結果呈現(xiàn)一致性。在檢測anisomycin誘導Jurkat T細胞的凋亡相關miRNA表達譜中，與對照組相比，16種miRNA表達上調(diào)，31種表達下調(diào)。選擇7種表達差異明顯的miRNAs，即let-7c、miR-26、 miR-133b、miR-144、miR-193a、miR-296和miR-337進行qPCR驗證，發(fā)現(xiàn)let-7c與miR-133b表達差異穩(wěn)定，并具有生物重復性。Let-7c-mimic和Let-7c-inhibitor的作用顯示，Let-7c可上調(diào)Jurkat T細胞的凋亡，與P-BCL-XL及P-Bim蛋白的上調(diào)密切關聯(lián)。結論：anisomycin能誘導Jurkat T細胞的let-7c、miR-26、 miR-144、miR-193a和miR-337上調(diào)，下調(diào)miR-296和miR-133b的表達；anisomycin可能通過let-7c調(diào)控P-BCL-XL和P-Bim的表達從而誘導Jurkat T細胞凋亡。
【關鍵詞】：anisomycin let-7c BCL-XL miRNAs 細胞凋亡 Jurkat T
【學位授予單位】：暨南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R363;Q255
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 前言10-17
• 1 miRNA 的特性和功能10-11
• 2 miRNA 在細胞凋亡中的作用11-13
• 3 anisomycin 的結構和功能13-14
• 4 anisomycin 誘導凋亡的可能機制14-15
• 5 研究思路與目的15-17
• 材料和方法17-33
• 1 主要試劑17-18
• 2 主要儀器18
• 3 主要溶液的配制18-21
• 4 細胞與培養(yǎng)21
• 4.1 細胞株21
• 4.2 細胞培養(yǎng)21
• 4.3 細胞傳代21
• 5 流式細胞術檢測細胞凋亡21-22
• 6 Western Blot22-23
• 6.1 細胞處理22
• 6.2 蛋白的提取與定量22
• 6.3 電泳22-23
• 6.4 轉膜23
• 6.5 抗體結合及顯色23
• 7 報告基因 array 檢測凋亡相關轉錄因子的活性23-25
• 7.1 質(zhì)粒轉染及細胞處理23-24
• 7.2 RNA 的提取24
• 7.3 TF Reporter plate array24-25
• 8 EMSA 檢測 AP-1 的 DNA 結合活性25-28
• 8.1 細胞處理25
• 8.2 核蛋白的提取25-26
• 8.3 EMSA 結合反應26
• 8.4 電泳26-27
• 8.5 轉膜27
• 8.6 檢測27-28
• 9 miRNA array 檢測凋亡相關 miRNA 表達譜28-29
• 9.1 細胞處理28
• 9.2 Apoptosis-associated miRNA Plate Array28-29
• 10 qPCR 確定差異表達的 miRNA29-32
• 10.1 逆轉錄29-30
• 10.2 q PCR30-32
• 11 let-7c-mimic 和 let-7c-inhibitor 的應用32
• 11.1 細胞處理及轉染32
• 12 流式細胞術分析 let-7c 在凋亡中的作用32
• 13 統(tǒng)計學分析32-33
• 結果33-43
• 1 anisomycin 誘導 Jurkat T 細胞凋亡33-34
• 2 anisomycin 上調(diào) P-BCL-XL 和 P-Bim 蛋白的水平34-36
• 2.1 anisomycin 上調(diào) P-BCL-XL 蛋白表達34-35
• 2.2 anisomycin 上調(diào) P-Bim 蛋白表達35-36
• 3 anisomycin 對 Jurkat T 細胞轉錄因子活性的影響36-37
• 4 anisomycin 對 AP-1 表達的影響37-39
• 5 anisomycin 誘導 Jurkat T 細胞 miRNA 差異表達的篩選39-40
• 6 anisomycin 誘導 Jurkat T 細胞凋亡中差異表達的 miRNA 的確定40-41
• 7 let-7c-mimic 及其抑制劑對 Jurkat T 細胞內(nèi) let-7c 含量的影響41
• 8 let-7c 在 anisomycin 誘導 Jurkat T 細胞凋亡中的作用41-42
• 9 let-7c 上調(diào) P-BCL-XL 和 P-Bim 的表達42-43
• 討論43-49
• 1 BCL-XL 與 Bim 參與 anisomycin 誘導的 Jurkat T 細胞凋亡43-44
• 2 轉錄因子在 anisomycin 誘導 Jurkat T 細胞凋亡中的作用44-46
• 3 let-7c 誘導凋亡的可能機制46-49
• 小結49-50
• 參考文獻50-54
• 發(fā)表論文54-55
• 致謝55-56
• 英文縮略詞表56-57

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  本文關鍵詞：miRNAlet-7c在anisomycin誘導JurkatT細胞凋亡中的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：367857