本文關(guān)鍵詞：抗人CD86單鏈抗體的研制及生物學(xué)功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：CD86（又稱(chēng)B7-2）是表達(dá)在抗原提呈細(xì)胞（antigen-presenting cell，APC）表面的重要共刺激分子，其受體是表達(dá)在T細(xì)胞表面的CD28分子。CD86與CD28結(jié)合轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號(hào)，對(duì)T細(xì)胞的活化、增殖與功能發(fā)揮起著重要作用。CD86的編碼基因?yàn)?120bp，由306個(gè)氨基酸組成，屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白。單鏈抗體（single chainvariable fragment，scFv）是一種新型重組抗體，是將抗體重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）用一條彈性短肽連接而成的小分子抗體片段，此類(lèi)抗體的優(yōu)點(diǎn)是分子量小、免疫原性弱、滲透性強(qiáng)、并具有藥物導(dǎo)向及中和毒素等功能。本研究在成功制備了鼠抗人CD86單克隆抗體及其相應(yīng)人-鼠嵌合抗體的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了抗人CD86-scFv的真核表達(dá)載體并在CHO細(xì)胞中得到穩(wěn)定表達(dá)，進(jìn)而對(duì)該抗體的生物學(xué)功能進(jìn)行了初步研究。 第一部分抗人CD86單鏈抗體（CD86-scFv）的構(gòu)建及表達(dá) 目的：構(gòu)建抗人CD86-scFv基因并在CHO細(xì)胞中表達(dá)，篩選穩(wěn)定表達(dá)該抗體的細(xì)胞株。 方法：采用RT-PCR從分泌鼠抗人CD86單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株（克隆號(hào)：1D1）中克隆VH及VL基因。重疊延伸拼接PCR（gene splicing by overlap extensionPCR，SOE-PCR）方法構(gòu)建具有前導(dǎo)肽的L-VH-Linker-VL單鏈抗體基因，并克隆至真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染至中華倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO），G418加壓篩選，采用流式細(xì)胞術(shù)鑒定出穩(wěn)定表達(dá)抗人CD86-scFv的細(xì)胞株。 結(jié)果：構(gòu)建的抗人CD86-scFv基因全長(zhǎng)為780bp，測(cè)序后經(jīng)BLAST比對(duì)，證明該序列為鼠源親本抗體的可變區(qū)基因，并含有信號(hào)肽、連接肽以及His標(biāo)簽。轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，G418加壓篩選后獲得了穩(wěn)定表達(dá)抗人CD86-scFv的細(xì)胞株，命名為SA-IV。培養(yǎng)上清與L929-CD86細(xì)胞的陽(yáng)性結(jié)合率為64.8%。 結(jié)論：成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)抗人CD86-scFv的細(xì)胞株SA-IV，為進(jìn)一步研究該抗體的生物學(xué)活性提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。 第二部分抗人CD86-scFv的生物學(xué)功能研究 目的：制備抗人CD86-scFv，分析其與不同人源細(xì)胞株膜型CD86分子的結(jié)合特性及介導(dǎo)的生物學(xué)功能。 方法：大批量培養(yǎng)細(xì)胞株SA-IV，收集上清，ProfinityTMIMAC鎳預(yù)裝柱分離純化CD86-scFv。采用流式細(xì)胞術(shù)分析CD86-scFv對(duì)基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株L929-CD86以及天然表達(dá)CD86分子的人B系淋巴瘤細(xì)胞Raji和Daudi膜型CD86分子的識(shí)別。競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)分析該抗體與鼠源親本抗體1D1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合相應(yīng)抗原的能力。在Raji細(xì)胞的培養(yǎng)體系中加入不同濃度的CD86-scFv，MTT法分析CD86-scFv對(duì)Raji細(xì)胞增殖的影響，流式細(xì)胞術(shù)分析該抗體誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡的作用。CD86-scFv與Raji細(xì)胞共孵育后接種BABL/c裸鼠，觀察抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞成瘤性的影響。 結(jié)果：經(jīng)大量培養(yǎng)SA-IV并收集培養(yǎng)上清，鎳預(yù)裝柱分離純化CD86-scFv的得率為4.2mg/L。CD86-scFv能特異性識(shí)別L929-CD86、Raji以及Daudi細(xì)胞表面的CD86分子，陽(yáng)性結(jié)合率分別為67.0%、72.3%及80.5%。該抗體對(duì)鼠源親本抗體1D1具有競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合能力。在Raji細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入CD86-scFv，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為28.3%，，凋亡率為11.2%。Raji細(xì)胞與CD86-scFv共孵育后接種BALA/c裸鼠，成瘤（直徑4-5mm）時(shí)間較對(duì)照組推遲6-8天，在60天的觀察期內(nèi)，抗體處理組腫瘤的平均體積較對(duì)照組小30%。 結(jié)論：研制的抗人CD86-scFv能夠與相應(yīng)抗原分子結(jié)合，體內(nèi)、外對(duì)高表達(dá)CD86分子的腫瘤細(xì)胞均具有生長(zhǎng)抑制作用。
【關(guān)鍵詞】：CD86 單鏈抗體 真核表達(dá) 腫瘤抑制
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R392
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-9
• 研究背景9-18
• 1. B7 分子的結(jié)構(gòu)及表達(dá)9-10
• 2. 基因工程抗體的表達(dá)10-11
• 3. B7 分子與疾病11-12
• 4. 基因工程抗體的研制及應(yīng)用研究12-14
• 參考文獻(xiàn)14-18
• 第一部分 抗人 CD86 單鏈抗體（scFv）的構(gòu)建及表達(dá)18-38
• 1. 材料和試劑18-20
• 2. 方法20-27
• 3. 結(jié)果27-33
• 4. 討論33-36
• 參考文獻(xiàn)36-38
• 第二部分：抗人 CD86-scFv 的生物學(xué)功能研究38-50
• 1. 試劑和材料38-39
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法39-42
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果42-47
• 4. 討論47-48
• 參考文獻(xiàn)48-50
• 全文總結(jié)與展望50-51
• 綜述：基因工程小分子抗體的研制及應(yīng)用研究51-59
• 參考文獻(xiàn)56-59
• 本研究所獲得的基金資助59-60
• 碩士研究生期間發(fā)表的論文60-61
• 縮略詞61-62
• 致謝62-63

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 胡春艷;劉全忠;;單克隆抗體制備技術(shù)及應(yīng)用的研究進(jìn)展[J];安徽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;2008年02期

2 鐘小林,高會(huì)廣,吉清,黃剛;一種可溶性單抗ScFv片段的表達(dá)及鑒定[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2003年08期

3 湯正好;基因工程單鏈抗體在傳染病中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(流行病學(xué)傳染病學(xué)分冊(cè));2002年03期

4 何云燕;夏云;;基因工程單鏈抗體及其應(yīng)用[J];國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2006年09期

5 陳潔;孫中文;;CD80和CD86介導(dǎo)的共刺激信號(hào)的比較及其生物學(xué)作用[J];國(guó)際免疫學(xué)雜志;2006年01期

6 張宏斌,江悅?cè)A,王捷,楊太成,王元利,譚尚恒,于茂生;抗人膀胱癌噬菌體單鏈抗體的初步制備[J];免疫學(xué)雜志;1997年02期

7 陶然;石云杰;孫中文;馬泓冰;徐穎;程鋼;孫瑋麗;周立峰;邱玉華;張學(xué)光;;鼠抗人B7-2單克隆抗體的研制及生物學(xué)特性研究[J];現(xiàn)代免疫學(xué);2006年03期

8 胡玲玲;徐耀瑜;陳永井;馬泓冰;程鋼;劉玉華;王艷茹;孫杰;陳明心;邱玉華;;抗人CD86人-鼠嵌合抗體的構(gòu)建及在CHO細(xì)胞的表達(dá)[J];現(xiàn)代免疫學(xué);2008年02期

9 費(fèi)晉秀,任軍,苗繼延;單鏈抗體構(gòu)建、表達(dá)及臨床應(yīng)用的研究現(xiàn)狀[J];陜西醫(yī)學(xué)雜志;2000年01期

10 湯琳,莊羽美,周照華,余葛華,潘建忠,張學(xué)光;激發(fā)型抗CD40單抗介導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)胞凋亡及其機(jī)制探討[J];蘇州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2002年04期

  本文關(guān)鍵詞：抗人CD86單鏈抗體的研制及生物學(xué)功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：367056