發(fā)布時間：2017-05-15 03:09

  本文關鍵詞：基于等溫雜交鏈式反應的無標記化學發(fā)光DNA檢測新技術，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：據(jù)現(xiàn)代醫(yī)學和生命科學的研究成果,許多疾病如癌癥和遺傳病的發(fā)生和發(fā)展都與基因的突變有關,另外許多傳染性疾病是由環(huán)境中的病毒所引起的,因此對特定序列DNA的分析以及對DNA鏈中堿基突變的檢測在基因篩選、法醫(yī)學鑒定、遺傳疾病的早期診斷和治療、病原基因的測定方面具有十分深遠的理論意義和應用價值。近年來,快速可靠的特定序列DNA檢測技術得以迅速發(fā)展,按照有無標記物可分為標記和無標記兩類。標記的DNA檢測技術靈敏度高,但在一定程度上檢測過程更為復雜,且檢測成本較高。相對而言,無標記的DNA檢測技術一般較為簡單快速,成本相對較低,已將其廣泛應用于分子生物學、法醫(yī)學、臨床診斷學等領域。 化學發(fā)光(CL)分析是根據(jù)化學反應產(chǎn)生的光輻射確定物質含量的一種痕量分析方法。CL分析具有靈敏度高、線性范圍寬(3-6個數(shù)量級)、分析速度快以及儀器設備相對簡單、便宜等優(yōu)點,已成為現(xiàn)代痕量分析中一個十分活躍的研究和應用領域。2003年課題組首次報道了基于鳥嘌呤特異性CL的無標記(磁性微球表面瞬時衍生)DNA檢測新技術,發(fā)表在《Chemical Communications》(2003,2888-2889)。它是將無鳥嘌呤的DNA探針固定于磁性微球,雜交端粒序列后,利用特異性CL反應試劑——3,4,5三甲氧基苯甲酰甲醛(TMPG)與目標序列中鳥嘌呤產(chǎn)生瞬時的CL,進行端粒檢測。2008年,課題組偶合PCR技術,發(fā)展了依據(jù)不同載體物理性質差異識別、無標記型多組分CL檢測新技術,成功應用于3種乙肝病毒DNA的檢測,發(fā)表在2008年的《Analytical Chemistry》(2008,1606-1613)。2011年,課題組通過將成百上千條的適配體序列自組裝于聚苯乙烯微球表面,實現(xiàn)了蛋白質IgE的高靈敏度、無標記CL檢測。 核酸擴增技術是指在分子生物學中對特定的DNA序列進行體外擴增的一種技術,如傳統(tǒng)的聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)以及近年來發(fā)展起來的等溫擴增技術如滾環(huán)擴增反應(Rolling Circle Amplification, RCA)口雜交鏈式反應(Hybridization Chain Reaction, HCR),已廣泛應用在特定DNA序列、蛋白質和小分子等物質的高靈敏檢測中。 在課題組目前研究工作的基礎上,本論文將CL分析和等溫雜交鏈式擴增技術相結合,發(fā)展了兩種具有創(chuàng)新意義的高靈敏度無標記DNA的CL檢測技術,全文由以下三部分構成： 第一章：DNA檢測意義與研究進展 第一節(jié)主要介紹課題背景及研究意義：包括特定序列DNA檢測的意義、新型核酸等溫擴增技術和無標記DNA檢測的新進展。第二節(jié)主要介紹了CL分析技術的基本原理及特點,并介紹CL分析技術在DNA分析領域的應用。第三節(jié)主要闡述了本論文的研究目的、意義,并概括論文的主要研究內容及創(chuàng)新之處。 第二章：偶合雜交鏈式反應的無標記化學發(fā)光DNA檢測新技術 本章偶合HCR放大反應,建立了特定序列DNA的無標記CL檢測新技術。CL信號由特異性化學發(fā)光試劑3,4,5-三甲氧基苯甲酰甲醛(TMPG)與DNA序列中G堿基發(fā)生瞬時衍生反應產(chǎn)生,無需標記。實驗中首先驗證了無標記檢測技術的可行性,隨后詳細考察了HCR放大效果,并優(yōu)化了各項實驗參數(shù),如磁性微球的用量,捕獲探針的用量和HCR反應條件等。研究發(fā)現(xiàn),在1finol-5pmol(10pM-50nM)的濃度范圍內,CL強度與目標DNA濃度呈線性相關(LogI=0.751LogC+2.001,R2=0.993),最低可檢測濃度為1pM。該技術采用磁性微球作為富集載體,具有操作簡單、快速、靈敏度高的特點。 第三章：聚苯乙烯微球-雜交鏈式反應雙重放大的無標記化學發(fā)光DNA檢測新技術 在第二章工作的基礎上,本章進一步構建了一種基于聚苯乙烯微球-HCR雙重放大的特定序列DNA的檢測新技術。首先將捕獲探針通過羧基-氨基反應固定在磁性微球上表面,報告探針和HCR引發(fā)探針通過鏈霉親和素-生物素反應自組裝在聚苯乙烯微球表面形成放大復合物；目標DNA加入后,將聚苯乙烯微球放大復合物雜交在磁性微球表面。由于每個聚苯乙烯微球表面結合有大量含有G堿基報告探針和HCR引發(fā)探針,構成一級放大；隨后加入兩種HCR單體,進行HCR擴增反應,得以在磁性微球表面第二次引入大量的G堿基,構成第二級放大,然后磁性分離,TMPG檢測。結果表明：該方法具有操作簡單、穩(wěn)定可靠、快速靈敏,檢測時間短的特點,在0.01finol-10pmol (0.1pM-100nM)濃度范圍內具有良好的線性關系(R2=0.991),最低可檢測濃度為5amol(50fM),與第二章第一節(jié)直接檢測方法相比,該法靈敏度提高2×104倍；與第二章第二節(jié)采用HCR反應作為放大技術相比,靈敏度提高了20倍。錯配識別能力強。綜上所述,本章構建的新技術非常適合于高靈敏度特定序列DNA的檢測。
【關鍵詞】：磁性微球 化學發(fā)光 無標記 特定序列DNA 雜交鏈式反應 放大載體 聚苯乙烯微球
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R3416
【目錄】：

• 目錄4-6
• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 第一章 DNA檢測意義與研究進展11-36
• 第一節(jié) 課題背景及意義11-18
• 1.1 DNA檢測基本原理11-13
• 1.2 核酸等溫擴增技術13-16
• 1.3 無標記DNA檢測技術的研究進展16-18
• 第二節(jié) 化學發(fā)光DNA檢測技術的研究進展18-25
• 2.1 CL基本原理18-19
• 2.2 標記的CL檢測技術19-21
• 2.3 無標記的CL檢測技術21-25
• 第三節(jié) 論文研究內容及創(chuàng)新點25-26
• 參考文獻26-36
• 第二章 偶合雜交鏈式反應的無標記化學發(fā)光DNA檢測新技術36-60
• 摘要36-37
• 第一節(jié) 無標記化學發(fā)光檢測特定DNA序列的研究37-43
• 1.1 引言37
• 1.2 實驗部分37-38
• 1.3 實驗方法38-39
• 1.4 結果與討論39-42
• 1.5 總結42-43
• 第二節(jié) 基于鏈式雜交反應的無標記化學發(fā)光檢測特定DNA序列的新技術43-57
• 2.1 引言43
• 2.2 實驗部分43-45
• 2.3 實驗方法45-47
• 2.4 結果與討論47-56
• 2.5 總結56-57
• 參考文獻57-60
• 第三章 聚苯乙烯微球-雜交鏈式反應雙重放大的無標記化學發(fā)光DNA檢測新技術60-76
• 摘要60-61
• 3.1 引言61
• 3.2 實驗部分61-63
• 3.3 實驗方法63-65
• 3.4 結果與討論65-73
• 3.5 總結73-74
• 參考文獻74-76
• 發(fā)表論文76-77
• 致謝77-78

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