發(fā)布時間：2017-05-14 08:13

  本文關(guān)鍵詞：microRNA-125b促進巨核系造血細胞分化及其調(diào)控機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目前血小板需求量大，而來源緊張及潛在的血液傳播疾病使得血小板的臨床應用面臨嚴峻挑戰(zhàn)，為尋找更為安全充足的血小板替代品，許多研究人員將目光投向干細胞體外定向誘導分化技術(shù)。然而目前體外誘導生成巨核系細胞及血小板仍有很多技術(shù)問題亟需解決，并且體外分化的分子調(diào)控機制尚不十分清楚，因此本研究擬以臍帶血造血干/祖細胞為起始細胞，體外誘導其向巨核細胞分化，并在此過程中首先對誘導培養(yǎng)體系進行優(yōu)化，進而選取在巨核系分化過程中表達量呈現(xiàn)特異性變化的一種miRNA，即miR-125b，深入分析miR-125b對巨核系分化影響，并對此過程中的分子機制進行深入探討。 本課題共分為三個部分： 第一部分：臍帶血造血干/祖細胞向巨核細胞分化體系的建立與優(yōu)化 方法：首先建立以間充質(zhì)干細胞為基質(zhì)細胞的巨核系誘導體系。分離得到骨髓和臍帶兩種來源的間充質(zhì)干細胞，并對兩種來源的間充質(zhì)干細胞進行表面標志和多向分化能力的鑒定，同時通過實時定量PCR和對RT-PCR產(chǎn)物的電泳分析，對比相同培養(yǎng)代數(shù)下兩種間充質(zhì)干細胞表達造血因子的情況。用梯度離心法分離得到單個核細胞，通過直接接觸或Trans-well分隔的方式分別與間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)，觀察細胞增殖情況，并檢測巨核系特異性的表面標志和相關(guān)基因及某些miRNA的表達量。同時優(yōu)化了無基質(zhì)細胞培養(yǎng)體系，對比兩種不同基礎培養(yǎng)基Xvivo-15和Stemspan對巨核系分化的影響。 結(jié)果：骨髓和臍帶來源的間充質(zhì)干細胞均分泌對巨核細胞增殖和分化有促進作用的造血因子，與造血干/祖細胞直接共培養(yǎng)，對于巨核細胞的增殖有明顯的促進作用，但分化效果不明顯；在非接觸共培養(yǎng)的條件下，對巨核細胞的增殖及分化都產(chǎn)生明顯的促進作用，且骨髓來源的間充質(zhì)干細胞較臍帶來源的效果更顯著；在對比不同共培養(yǎng)方式對巨核系分化的影響的同時，發(fā)現(xiàn)miR-125b的表達量與細胞向巨核系分化的程度成正比，以此推測miR-125b可能參與到MNC向巨核系分化的過程中。 第二部分：miR-125b促進造血干/祖細胞向巨核細胞分化及其作用機制 方法：在造血干/祖細胞向巨核系分化的過程中選取不同的時間點以及不同成熟程度的細胞群，對其中miR-125b的表達情況進行檢測，觀察在巨核系分化過程中miR-125b的內(nèi)源性變化趨勢，并通過瞬時轉(zhuǎn)染的方式，在MNC中外源性過表達或下調(diào)表達miR-125b后，在巨核誘導培養(yǎng)基中進行誘導分化，觀察細胞的與巨核系分化相關(guān)的生物學特性的改變，同時利用紅白血病細胞K562的巨核系分化模型，建立并篩選出能夠穩(wěn)定過表達miR-125b的K562細胞，進行巨核誘導，觀察在此過程中miR-125b對K562細胞向巨核細胞分化的影響。 結(jié)果：在MNC向巨核系分化過程中，miR-125b的表達量呈現(xiàn)出先輕微下降再明顯升高的變化趨勢，并在成熟的巨核細胞和血小板中大量表達；通過轉(zhuǎn)染的方式，能夠外源性改變miR-125b的表達量，并且過表達miR-125b對巨核系分化有明顯促進作用，而下調(diào)miR-125b的表達則會明顯抑制該過程的發(fā)生，在穩(wěn)定過表達miR-125b的K562細胞中也觀察到miR-125b對巨核系分化的明顯的促進作用，與原代細胞中的結(jié)果一致。由此推斷miR-125b參與造血干/祖細胞向巨核細胞分化，并且在這個過程中起到了促進的作用。 第三部分參與巨核系分化的miR-125b靶基因的確定和驗證。 方法：通過生物信息學預測和相關(guān)文獻調(diào)研，選取若干miR-125b的靶基因進行檢測，并最終著眼于細胞周期相關(guān)基因p19INK4D。觀察miR-125b對靶基因p19INK4D的作用，，檢測在巨核系分化過程中p19INK4D的內(nèi)源性表達變化，并且在K562和UT-7兩種人白血病細胞系中外源性直接下調(diào)表達p19INK4D驗證其對細胞增殖和巨核系分化的影響。 結(jié)果：通過熒光素酶報告實驗及實時定量PCR、westernblot等實驗證實，miR-125b可以通過不完全互補配對的方式結(jié)合在p19INK4D的3’UTR，并且在mRNA和蛋白水平下調(diào)p19INK4D的表達，p19INK4D在巨核系分化過程中的表達變化與miR-125b的變化相對應；而且p19INK4D的下調(diào)表達可以促進細胞向巨核系分化。因此我們有理由得出如下結(jié)論miR-125b通過下調(diào)p19INK4D來促進造血干/祖細胞向巨核系分化。 本實驗基于實驗室以往的工作基礎，通過嘗試與間充質(zhì)干細胞以不同方式共培養(yǎng)和對于無基質(zhì)細胞培養(yǎng)體系的基礎培養(yǎng)基的對比，為今后進一步優(yōu)化巨核系誘導分化體系奠定了基礎，并對未來體外大規(guī)模制備巨核系祖細胞應用于臨床治療有一定的指導作用。而在這一基礎上觀察到miR-125b的特異性表達變化趨勢，并由此進一步關(guān)注miR-125b在巨核系分化過程中的表達變化，通過外源性改變miR-125b的表達量觀察對巨核系分化的影響，確定miR-125b促進巨核系分化的作用，并對其機制進行探討，深入闡釋了miRNA在調(diào)控巨核系分化中的作用和機理，為進一步調(diào)控造血干/祖細胞來更高效獲取成熟的巨核細胞提供了理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：巨核細胞 分化 miR-125b p19INK4D
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R329
【目錄】：

• 縮略詞表5-7
• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-17
• 一、 研究背景12-16
• 二、 研究目的和內(nèi)容16-17
• 第一部分 臍帶血造血干/祖細胞向巨核細胞分化體系的建立與優(yōu)化17-43
• 第一節(jié) 間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)及鑒定17-26
• （一）材料與方法17-23
• （二）實驗結(jié)果23-26
• 第二節(jié) 接觸共培養(yǎng)方式下間充質(zhì)干細胞促進造血干/祖細胞向巨核系分化26-31
• （一）材料與方法26-29
• （二）實驗結(jié)果29-31
• 第三節(jié) 非接觸與接觸共培養(yǎng)體系中造血干/祖細胞向巨核系分化的比較研究31-36
• （一）材料與方法31-33
• （二）實驗結(jié)果33-36
• 第四節(jié) 建立無基質(zhì)細胞的巨核系誘導分化體系36-41
• （一）材料與方法36-37
• （二）實驗結(jié)果37-41
• 討論41-42
• 小結(jié)42-43
• 第二部分 miR-125b 促進造血干/祖細胞向巨核細胞的分化及其作用機制43-56
• 第一節(jié) 檢測巨核系分化成熟過程中 miR-125b 的內(nèi)源性變化43-46
• （一）材料與方法43-44
• （二）實驗結(jié)果44-46
• 第二節(jié) 外源性過表達或下調(diào)表達 miR-125b 對巨核系分化的影響46-54
• （一）材料與方法46-49
• （二）實驗結(jié)果49-54
• 討論54-55
• 小結(jié)55-56
• 第三部分 參與巨核系分化的 miR-125b 靶基因的確定和驗證56-71
• 第一節(jié) 參與巨核系分化的 miR-125b 靶基因的篩選56-66
• （一）材料與方法56-60
• （二）實驗結(jié)果60-66
• 第二節(jié) 直接下調(diào)表達 miR-125b 的靶基因 p19INK4D對巨核系分化的影響66-70
• （一）材料與方法66
• （二）實驗結(jié)果66-70
• 討論70
• 小結(jié)70-71
• 總結(jié)71-72
• 參考文獻72-76
• 與學位論文密切相關(guān)的該研究領域文獻綜述76-84
• 參考文獻81-84
• 致謝84-86

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 降央澤仁;賴麗;官彥;黃茜;黃曉芹;;巴桑母酥油丸對放射線-化學復合損傷小鼠骨髓造血組織面積和基質(zhì)細胞粘附力的影響[J];成都中醫(yī)藥大學學報;2014年01期

2 杜剛;黃克;李林;梁紅鎖;唐俊;李紅波;;富血小板血漿對骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞定向分化的影響[J];山西醫(yī)科大學學報;2013年10期

3 曲m:逸;王靜雪;王思涵;房芳;陳琳;張文成;賈雅麗;岳文;謝小燕;裴雪濤;;間充質(zhì)干細胞對造血干/祖細胞分化為巨核細胞的影響[J];生物技術(shù)通訊;2014年03期

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 張征崢;microRNA-155調(diào)節(jié)小鼠乳腺癌細胞株4T1生物學行為及相關(guān)機制研究[D];河北醫(yī)科大學;2014年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 段相會;血管生成素1在G-CSF誘導的造血干細胞動員中的作用及其機制研究[D];廣西醫(yī)科大學;2013年

2 李娜;冠心病患者血小板相關(guān)microRNA的表達及其意義[D];蚌埠醫(yī)學院;2014年

3 斯思;miR-27a在紅系分化中的作用機制[D];川北醫(yī)學院;2014年

4 寧小毅;G-CSF對小鼠成骨細胞及OCN、SDF-1、Ang1表達的影響[D];廣西醫(yī)科大學;2014年

5 劉茂玄;復方阿膠漿對貧血的治療作用及作用機制的研究[D];山東大學;2014年

  本文關(guān)鍵詞：microRNA-125b促進巨核系造血細胞分化及其調(diào)控機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：364645