本文關(guān)鍵詞：microRNA-125b促進(jìn)巨核系造血細(xì)胞分化及其調(diào)控機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目前血小板需求量大，而來源緊張及潛在的血液傳播疾病使得血小板的臨床應(yīng)用面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，為尋找更為安全充足的血小板替代品，許多研究人員將目光投向干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化技術(shù)。然而目前體外誘導(dǎo)生成巨核系細(xì)胞及血小板仍有很多技術(shù)問題亟需解決，并且體外分化的分子調(diào)控機(jī)制尚不十分清楚，因此本研究擬以臍帶血造血干/祖細(xì)胞為起始細(xì)胞，體外誘導(dǎo)其向巨核細(xì)胞分化，并在此過程中首先對誘導(dǎo)培養(yǎng)體系進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)而選取在巨核系分化過程中表達(dá)量呈現(xiàn)特異性變化的一種miRNA，即miR-125b，深入分析miR-125b對巨核系分化影響，并對此過程中的分子機(jī)制進(jìn)行深入探討。 本課題共分為三個部分： 第一部分：臍帶血造血干/祖細(xì)胞向巨核細(xì)胞分化體系的建立與優(yōu)化 方法：首先建立以間充質(zhì)干細(xì)胞為基質(zhì)細(xì)胞的巨核系誘導(dǎo)體系。分離得到骨髓和臍帶兩種來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，并對兩種來源的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行表面標(biāo)志和多向分化能力的鑒定，同時通過實(shí)時定量PCR和對RT-PCR產(chǎn)物的電泳分析，對比相同培養(yǎng)代數(shù)下兩種間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)造血因子的情況。用梯度離心法分離得到單個核細(xì)胞，通過直接接觸或Trans-well分隔的方式分別與間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察細(xì)胞增殖情況，并檢測巨核系特異性的表面標(biāo)志和相關(guān)基因及某些miRNA的表達(dá)量。同時優(yōu)化了無基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)體系，對比兩種不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基Xvivo-15和Stemspan對巨核系分化的影響。 結(jié)果：骨髓和臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞均分泌對巨核細(xì)胞增殖和分化有促進(jìn)作用的造血因子，與造血干/祖細(xì)胞直接共培養(yǎng)，對于巨核細(xì)胞的增殖有明顯的促進(jìn)作用，但分化效果不明顯；在非接觸共培養(yǎng)的條件下，對巨核細(xì)胞的增殖及分化都產(chǎn)生明顯的促進(jìn)作用，且骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞較臍帶來源的效果更顯著；在對比不同共培養(yǎng)方式對巨核系分化的影響的同時，發(fā)現(xiàn)miR-125b的表達(dá)量與細(xì)胞向巨核系分化的程度成正比，以此推測miR-125b可能參與到MNC向巨核系分化的過程中。 第二部分：miR-125b促進(jìn)造血干/祖細(xì)胞向巨核細(xì)胞分化及其作用機(jī)制 方法：在造血干/祖細(xì)胞向巨核系分化的過程中選取不同的時間點(diǎn)以及不同成熟程度的細(xì)胞群，對其中miR-125b的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，觀察在巨核系分化過程中miR-125b的內(nèi)源性變化趨勢，并通過瞬時轉(zhuǎn)染的方式，在MNC中外源性過表達(dá)或下調(diào)表達(dá)miR-125b后，在巨核誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)分化，觀察細(xì)胞的與巨核系分化相關(guān)的生物學(xué)特性的改變，同時利用紅白血病細(xì)胞K562的巨核系分化模型，建立并篩選出能夠穩(wěn)定過表達(dá)miR-125b的K562細(xì)胞，進(jìn)行巨核誘導(dǎo)，觀察在此過程中miR-125b對K562細(xì)胞向巨核細(xì)胞分化的影響。 結(jié)果：在MNC向巨核系分化過程中，miR-125b的表達(dá)量呈現(xiàn)出先輕微下降再明顯升高的變化趨勢，并在成熟的巨核細(xì)胞和血小板中大量表達(dá)；通過轉(zhuǎn)染的方式，能夠外源性改變miR-125b的表達(dá)量，并且過表達(dá)miR-125b對巨核系分化有明顯促進(jìn)作用，而下調(diào)miR-125b的表達(dá)則會明顯抑制該過程的發(fā)生，在穩(wěn)定過表達(dá)miR-125b的K562細(xì)胞中也觀察到miR-125b對巨核系分化的明顯的促進(jìn)作用，與原代細(xì)胞中的結(jié)果一致。由此推斷miR-125b參與造血干/祖細(xì)胞向巨核細(xì)胞分化，并且在這個過程中起到了促進(jìn)的作用。 第三部分參與巨核系分化的miR-125b靶基因的確定和驗(yàn)證。 方法：通過生物信息學(xué)預(yù)測和相關(guān)文獻(xiàn)調(diào)研，選取若干miR-125b的靶基因進(jìn)行檢測，并最終著眼于細(xì)胞周期相關(guān)基因p19INK4D。觀察miR-125b對靶基因p19INK4D的作用，，檢測在巨核系分化過程中p19INK4D的內(nèi)源性表達(dá)變化，并且在K562和UT-7兩種人白血病細(xì)胞系中外源性直接下調(diào)表達(dá)p19INK4D驗(yàn)證其對細(xì)胞增殖和巨核系分化的影響。 結(jié)果：通過熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)及實(shí)時定量PCR、westernblot等實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miR-125b可以通過不完全互補(bǔ)配對的方式結(jié)合在p19INK4D的3’UTR，并且在mRNA和蛋白水平下調(diào)p19INK4D的表達(dá)，p19INK4D在巨核系分化過程中的表達(dá)變化與miR-125b的變化相對應(yīng)；而且p19INK4D的下調(diào)表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞向巨核系分化。因此我們有理由得出如下結(jié)論miR-125b通過下調(diào)p19INK4D來促進(jìn)造血干/祖細(xì)胞向巨核系分化。 本實(shí)驗(yàn)基于實(shí)驗(yàn)室以往的工作基礎(chǔ)，通過嘗試與間充質(zhì)干細(xì)胞以不同方式共培養(yǎng)和對于無基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)體系的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的對比，為今后進(jìn)一步優(yōu)化巨核系誘導(dǎo)分化體系奠定了基礎(chǔ)，并對未來體外大規(guī)模制備巨核系祖細(xì)胞應(yīng)用于臨床治療有一定的指導(dǎo)作用。而在這一基礎(chǔ)上觀察到miR-125b的特異性表達(dá)變化趨勢，并由此進(jìn)一步關(guān)注miR-125b在巨核系分化過程中的表達(dá)變化，通過外源性改變miR-125b的表達(dá)量觀察對巨核系分化的影響，確定miR-125b促進(jìn)巨核系分化的作用，并對其機(jī)制進(jìn)行探討，深入闡釋了miRNA在調(diào)控巨核系分化中的作用和機(jī)理，為進(jìn)一步調(diào)控造血干/祖細(xì)胞來更高效獲取成熟的巨核細(xì)胞提供了理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：巨核細(xì)胞 分化 miR-125b p19INK4D
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R329
【目錄】：

• 縮略詞表5-7
• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-17
• 一、 研究背景12-16
• 二、 研究目的和內(nèi)容16-17
• 第一部分 臍帶血造血干/祖細(xì)胞向巨核細(xì)胞分化體系的建立與優(yōu)化17-43
• 第一節(jié) 間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定17-26
• （一）材料與方法17-23
• （二）實(shí)驗(yàn)結(jié)果23-26
• 第二節(jié) 接觸共培養(yǎng)方式下間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)造血干/祖細(xì)胞向巨核系分化26-31
• （一）材料與方法26-29
• （二）實(shí)驗(yàn)結(jié)果29-31
• 第三節(jié) 非接觸與接觸共培養(yǎng)體系中造血干/祖細(xì)胞向巨核系分化的比較研究31-36
• （一）材料與方法31-33
• （二）實(shí)驗(yàn)結(jié)果33-36
• 第四節(jié) 建立無基質(zhì)細(xì)胞的巨核系誘導(dǎo)分化體系36-41
• （一）材料與方法36-37
• （二）實(shí)驗(yàn)結(jié)果37-41
• 討論41-42
• 小結(jié)42-43
• 第二部分 miR-125b 促進(jìn)造血干/祖細(xì)胞向巨核細(xì)胞的分化及其作用機(jī)制43-56
• 第一節(jié) 檢測巨核系分化成熟過程中 miR-125b 的內(nèi)源性變化43-46
• （一）材料與方法43-44
• （二）實(shí)驗(yàn)結(jié)果44-46
• 第二節(jié) 外源性過表達(dá)或下調(diào)表達(dá) miR-125b 對巨核系分化的影響46-54
• （一）材料與方法46-49
• （二）實(shí)驗(yàn)結(jié)果49-54
• 討論54-55
• 小結(jié)55-56
• 第三部分 參與巨核系分化的 miR-125b 靶基因的確定和驗(yàn)證56-71
• 第一節(jié) 參與巨核系分化的 miR-125b 靶基因的篩選56-66
• （一）材料與方法56-60
• （二）實(shí)驗(yàn)結(jié)果60-66
• 第二節(jié) 直接下調(diào)表達(dá) miR-125b 的靶基因 p19INK4D對巨核系分化的影響66-70
• （一）材料與方法66
• （二）實(shí)驗(yàn)結(jié)果66-70
• 討論70
• 小結(jié)70-71
• 總結(jié)71-72
• 參考文獻(xiàn)72-76
• 與學(xué)位論文密切相關(guān)的該研究領(lǐng)域文獻(xiàn)綜述76-84
• 參考文獻(xiàn)81-84
• 致謝84-86

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 降央澤仁;賴麗;官彥;黃茜;黃曉芹;;巴桑母酥油丸對放射線-化學(xué)復(fù)合損傷小鼠骨髓造血組織面積和基質(zhì)細(xì)胞粘附力的影響[J];成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報;2014年01期

2 杜剛;黃克;李林;梁紅鎖;唐俊;李紅波;;富血小板血漿對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞定向分化的影響[J];山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2013年10期

3 曲m:逸;王靜雪;王思涵;房芳;陳琳;張文成;賈雅麗;岳文;謝小燕;裴雪濤;;間充質(zhì)干細(xì)胞對造血干/祖細(xì)胞分化為巨核細(xì)胞的影響[J];生物技術(shù)通訊;2014年03期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 張征崢;microRNA-155調(diào)節(jié)小鼠乳腺癌細(xì)胞株4T1生物學(xué)行為及相關(guān)機(jī)制研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2014年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 段相會;血管生成素1在G-CSF誘導(dǎo)的造血干細(xì)胞動員中的作用及其機(jī)制研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2013年

2 李娜;冠心病患者血小板相關(guān)microRNA的表達(dá)及其意義[D];蚌埠醫(yī)學(xué)院;2014年

3 斯思;miR-27a在紅系分化中的作用機(jī)制[D];川北醫(yī)學(xué)院;2014年

4 寧小毅;G-CSF對小鼠成骨細(xì)胞及OCN、SDF-1、Ang1表達(dá)的影響[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2014年

5 劉茂玄;復(fù)方阿膠漿對貧血的治療作用及作用機(jī)制的研究[D];山東大學(xué);2014年

  本文關(guān)鍵詞：microRNA-125b促進(jìn)巨核系造血細(xì)胞分化及其調(diào)控機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：364645