發(fā)布時間：2017-05-12 12:24

  本文關鍵詞：酒質在小鼠酒精肝造模過程中的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景 酒精性肝病(ALD)是指由于乙醇攝入過量而導致的肝臟損害等有一系列病變的疾病。根據(jù)2006年有中華醫(yī)學會會肝病分會脂肪肝和酒精性脂肪肝病學組制定的“酒精性肝病診療指南”,ALD可分為輕型ALD、酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纖維化和酒精性肝硬化(alcoholic cirrhosis, AC)五種類型。在西方國家,乙醇是導致肝硬化的最主要因素。英國基于1992年至2001年調查顯示酒精性肝硬化占所有肝硬化的38.3%,是肝硬化的主要原斟[1]。在我國酒精性肝病的發(fā)病率也日漸升高。穩(wěn)定可靠的動物模型是研究ALD的分子機制和防治措施的基礎。 研究發(fā)現(xiàn),慢性酒精性肝病的產(chǎn)生與胰島素抵抗的聯(lián)合效應有關[2-8],細胞內信號受損導致肝臟胰島素抵抗[9],同時也損害受體結合和受體酪氨酸激酶的活性[5,6]。乙醇也會抑制胰島素受體底物(IRS)蛋白的酪氨酸磷酸化[4,9].因此,慢性酒精性肝病抑制介導DNA合成和肝細胞再生的Erk絲裂原活化蛋白激酶和促進細胞生長、存活、葡萄糖的利用和能量代謝的磷脂酰肌醇激酶(phosphatidylinositol3-kinase, PI3K)[9,10]。在小鼠和huh-7肝癌細胞中急性酒精刺激可增加PTEN和PI3K的調節(jié)性亞基P85β的相互作用,Akt的磷酸化水平下降,損害胰島素信號通路[11,12]。胰島素抵抗可以損害脂質穩(wěn)態(tài),促進脂質分解[13]并增加脂質毒性,同時也增加了對PI3K/Akt通路的有抑制作用[14,15]和可進一步損害胰島素信號的神經(jīng)酰胺[16]。 PI3K/Akt通路可由多種細胞因子激活,是細胞功能調節(jié)的重要通路,包括轉錄、翻譯、細胞增殖及細胞凋亡[17,18]。胰島素與胰島素受體(Insulin Receptor,IR)的β亞基結合使IR磷酸化,激活的胰島素受體酪氨酸激酶使胰島素受體底物(Insulin Receptor Substrate, IRS)磷酸化。活化的IRS與具有SH2結構域的p85亞基結合,并進一步激活p110亞基,從而激活PI3K活性。PI3K的激活可使磷脂酰肌醇4,5二磷(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate, PI(4,5)P2)轉化成磷脂酰肌醇3,4,5二磷酸(PI(3,4,5)P3),PI(3,4,5)P3可進一步與Akt的PH結構域作用促使Akt變構,進而使位于Akt C末端調節(jié)結構域的Ser473殘基及激酶結構域Thr308殘基發(fā)生磷酸化�；罨腁kt通過各種下游信號調控細胞代謝、增殖、分化與凋亡。研究表明,PI3K/Akt通路的調控紊亂與多種疾病相關,如糖尿病、肝硬化、腫瘤[18,19]。 長期飲酒可導致胰島素抵抗等相關的疾病,肝硬化,肝纖維化,肝癌等。研究報道多以工業(yè)酒精做為動物研究時的模型。然而,酒精質量對研究結果的可能影響,罕有研究報道。該領域的研究,不僅有益于動物研究模型的優(yōu)化,對工業(yè)釀酒及健康可能有一定的啟示。 白酒的主要成分是乙醇和水,還包括構成酒體主要成分的有機酸、醇、酯、羰基化合物和芳香族化合物等[20]。由于地域的差異,貯酒容器和水質的不同,生產(chǎn)工藝的差別,使得各地所產(chǎn)的酒中微量元素含量也存在一定差異[21]。國家對白酒中甲醇含量規(guī)定了強制執(zhí)行標準,國內蒸餾酒和釀造酒的衛(wèi)生標準僅對Pb有限值要求,對Cr、As (GB-2757-81)、Cd、Hg等元素未作規(guī)定。 長期以來人們在復制酒精性肝病相似的動物病理模型方面做了不懈的努力,現(xiàn)國內外學者廣泛應用的ALD模型有Lieber-DeCarli(LD)液體飼料誘導的ALD模型、胃內插管灌注乙醇模型和LD飼料結合灌注模型。在配制液體飼料時常選用無水乙醇或是市售食用酒,對于兩類酒精飼養(yǎng)小鼠對造模產(chǎn)生的差異的研究報道很少。本研究旨在探討小鼠酒精肝造模過程中不同酒質對其體重、肝臟組織病理學及胰島素信號Akt磷酸化水平表達的影響。 第一部分95%工業(yè)酒精與酒精肝造模 目的 酒精性肝病是世界范圍內慢性肝病的一種主要原因,而與疾病進展相關的主要發(fā)病機制尚不明確,建立與人類酒精性肝損傷病變過程相似的動物模型具有積極的意義。因此我們選取應用最廣泛的酒精性肝損傷模型-LD模型,以探討酒精肝的發(fā)病機制。我們試圖慢性喂養(yǎng)小鼠含5%工業(yè)酒精的Lieber-DeCarl i液體飲食行酒精肝造模,并觀察小鼠體重變化、肝臟病理學及對Insulin/PI3K/Akt通路和MEK/ERK通路的影響。方法 1、慢性喂養(yǎng)小鼠含5%工業(yè)酒精的LD液體飲食行酒精肝造模。8-10周SPF級雄性Balb/c小鼠28只,隨機分為對照組和實驗組,實驗組小鼠喂養(yǎng)含5%工業(yè)酒精的LD液體飲食,對照組小鼠喂養(yǎng)對照液體飲食,總時間2個月,實驗過程中觀察小鼠的精神狀態(tài)、活動情況、皮毛光澤度、食欲等。每周測量空腹體重,處死前禁食12h,充分麻醉后立即取出肝臟以10%甲醛固定,脫水后行石蠟包埋切片,蘇木精-伊紅染色(HE),光鏡觀察病理變化(肝細胞變性、壞死、炎性細胞浸潤等),肝臟標本觀察肝臟的大小、外形、色澤、質地、切面情況。 2、檢測肝臟組織中Akt及ERK磷酸化水平。研磨肝臟組織,提取蛋白行western blot檢測Akt及ERK的磷酸化水平。 3、所得體重數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析,結果以“平均值±標準差”表示。兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗(Independent-Samples T Test),P值0.05定義為有顯著性差異。 結果 1、實驗過程中實驗組小鼠共有4只死亡,可能因為酒精中毒、重度營養(yǎng)不良等。對照組全部成活。 2、實驗組小鼠體重較對照組小鼠體重明顯減輕(p≤0.05),初期實驗組小鼠出現(xiàn)易激惹、食欲減退等現(xiàn)象,實驗后期精神萎靡、反映遲鈍、皮毛光澤度差部分出現(xiàn)脫毛。對照組小鼠則皮毛光澤、體態(tài)活潑、食欲正常,無嗜睡現(xiàn)象。 3、對照組小鼠肝臟表面光滑細潤、色紅、邊緣銳利、質地柔軟,相比之下,實驗組小鼠肝臟色澤較正常肝臟暗淡,肝臟體積略增大,包膜緊張光滑,邊緣圓鈍,質地中等。 4、對照組HE染色標本見肝細胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列,肝小葉輪廓清晰,肝索排列整齊。偶可見散在小泡狀脂肪滴,未見明顯肝細胞變性及炎癥細胞浸潤。實驗組可見肝細胞腫大,充滿大小不等的脂肪顆粒,細胞核被推向一側,間質內見炎癥細胞浸潤。 5、工業(yè)酒精實驗組小鼠肝臟Akt磷酸化水平低于對照組,差異具有顯著性(p0.05)；ERK的磷酸化水平未見明顯顯著性差異(p0.05)。 結論 工業(yè)酒精慢性喂養(yǎng)使小鼠體重明顯下降,小鼠肝臟Akt磷酸化水平的明顯抑制,提示不適合小鼠酒精肝的研究。 第二部分不同食用酒行小鼠酒精肝造模的差異比較 目的 前述實驗發(fā)現(xiàn)工業(yè)酒精會導致造模組小鼠體重的嚴重減輕,及肝臟Akt磷酸化水平的抑制。因此,我們嘗試使用食用酒造模。 方法 1、慢性喂養(yǎng)小鼠含5%食用酒精的LD液體飲食行酒精肝造模。8-10周SPF級雄性Balb/c小鼠60只,隨機分為食用酒A組和食用酒B組,每組隨機分為連續(xù)組、間隔10天組和間隔5天組,連續(xù)組為連續(xù)喂養(yǎng)酒精液體飲食40天；間隔10天及間隔5天組,慢性酒精飲食時間為40天,總時間為85天；每周稱量小鼠空腹體重。實驗過程中觀察小鼠的精神狀態(tài)、活動情況、皮毛光澤度、食欲等。實驗結束后處死小鼠,處死前充分麻醉后快速摘取肝臟,部分肝組織用4%中性甲醛溶液固定保存其余肝組織放入液氮中速凍,再移至-80℃冰箱長期保存。肝臟脫水后石蠟包埋切片,蘇木精一伊紅染色(HE),光鏡觀察病理變化(肝細胞變性、壞死、炎性細胞浸潤等),肝臟標本觀察肝臟的大小、外形、色澤、質地、切面情況。 2、檢測肝臟組織中Akt磷酸化水平。研磨肝臟組織,提取蛋白行western blot檢測Akt磷酸化水平。 3、統(tǒng)計分析方法基本同上節(jié)介紹。結果 1、在酒精飲食期間各組小鼠均有飲食量減少,精神狀態(tài)總體較之前工業(yè)酒精實驗組好、對照組略差,后期仍較為活潑,皮毛光澤度有所減退,皮膚彈性好,未見明顯脫毛。 2、持續(xù)飲酒40天條件下,兩食用酒組之間體重變化無明顯差異,但較之前工業(yè)酒精組體重減輕少(p0.05)；間隔10天和間隔5天酒精喂養(yǎng),食用酒B組較食用酒A組小鼠體重明顯增加(p0.05)。 3、各組小鼠肝臟色澤較正常肝臟暗淡,肝臟體積略增大,包膜緊張光滑,邊緣圓鈍,質地中等。HE染色標本顯微鏡下可見肝細胞腫大,充滿大小不等的脂肪顆粒,細胞核被推向一側,間質內見炎癥細胞浸潤。 4、在連續(xù)和間斷10天酒精喂養(yǎng)條件下,與食用酒B相比,食用酒A組小鼠肝組織Akt磷酸化水平顯著下降(p0.05)；在間隔5天條件下,食用酒A組與食用酒B組小鼠肝組織Akt磷酸化水平未見明顯差異(p0.05)。結論 本課題發(fā)現(xiàn),1)酒精的質量對酒精肝小鼠模型及該模型下胰島素信號的變化具有重要的影響。低質量的食用酒精可導致體重的較大降低,及Insulin/PI3K/Akt信號通路的較大抑制。2)因為酒精質量導致胰島素信號的不同損傷,這個發(fā)現(xiàn)可能解開一個一直被忽略的問題：慢性酒精對肝臟的毒害,可能不僅僅是(或不是)乙醇及其代謝物,而且涉及酒精質量中的其它成分。
【關鍵詞】：小鼠酒精模型體重增長肝臟病理 PI3KAkt
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R575.5;R-332
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 前言16-20
• 第一部分 95%工業(yè)酒精與酒精肝造模20-38
• 一、材料與方法20-30
• 二、結果30-35
• 三、討論35-38
• 第二部分 不同食用酒行小鼠酒精肝造模的差異比較38-60
• 一、材料與方法38-48
• 二、結果48-57
• 三、討論57-60
• 小結60-61
• 參考文獻61-67
• 中英文縮略詞對照表67-69
• 在讀期間已經(jīng)發(fā)表和將要發(fā)表的論文69-70
• 致謝70-71

【參考文獻】

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