本文關(guān)鍵詞：申克孢子絲菌雙相型轉(zhuǎn)換相關(guān)基因功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：申克孢子絲菌是一種重要的雙相型真菌，是孢子絲菌病的主要病原菌。近年來(lái)，免疫缺陷或受損患者的增加，導(dǎo)致全球范圍內(nèi)孢子絲菌病發(fā)病率逐年升高，且深部和系統(tǒng)性孢子絲菌病的病例不斷增多，已嚴(yán)重地影響到人類的健康，引起了廣泛的關(guān)注、成為研究的熱點(diǎn)之一。 本研究以申克孢子絲菌為研究對(duì)象，利用反向遺傳學(xué)、生物信息學(xué)及分子生物學(xué)等手段，首次建立了分離自肺孢子絲菌病患者的申克孢子絲菌分離株的T-DNA插入突變體庫(kù)；篩選并鑒定雙相型轉(zhuǎn)換相關(guān)基因；通過(guò)構(gòu)建基因敲除株和回復(fù)突變株來(lái)解析基因功能，以此明確雙相型轉(zhuǎn)換相關(guān)機(jī)制，為深入研究申克孢子絲菌的致病機(jī)制、防控孢子絲菌及新型抗真菌藥物的研發(fā)病奠定理論基礎(chǔ)和提供科學(xué)依據(jù)。 1.申克孢子絲菌IFM41598的T-DNA插入突變體庫(kù)的建立 本研究首次利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA插入技術(shù)建立了申克孢子絲菌IFM41598的T-DNA插入突變體系，具體條件為：將濃度為2106個(gè)/mL的申克孢子絲菌分生孢子與OD值為0.5-0.8的攜帶pBHt1質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌AGL-1等比例混合，在存在200μ M AS的條件下，誘導(dǎo)培養(yǎng)48h，經(jīng)150μ g/mL濃度的潮霉素篩選，25培養(yǎng)5d可獲得800個(gè)轉(zhuǎn)化子/2106個(gè)分生孢子，經(jīng)過(guò)多次轉(zhuǎn)化，共獲得了轉(zhuǎn)化子3000株，，初步建立了申克孢子絲菌IFM41598的T-DNA插入突變體庫(kù)。這一突變體庫(kù)的建立將為研究深部和系統(tǒng)性孢子絲菌病的病原菌提供材料，為解析基因功能，探討致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 2.雙相型轉(zhuǎn)換相關(guān)基因的篩選和鑒定 利用已經(jīng)建立的突變體庫(kù)，以庫(kù)中3000株突變體為研究材料，利用平板法對(duì)雙相型轉(zhuǎn)換發(fā)生改變的突變體進(jìn)行篩選，共計(jì)篩選獲得18株形態(tài)轉(zhuǎn)換發(fā)生異常的突變體；利用TAIL-PCR技術(shù)、測(cè)序技術(shù)及生物信息學(xué)分析，定位了6株突變體的打斷序列，分別為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因2個(gè)、交配性基因2個(gè)、己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因及自然抗性相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白基因。 3.雙相型轉(zhuǎn)換相關(guān)基因敲除株和回復(fù)突變株的構(gòu)建 利用分子克隆技術(shù)、重疊延伸PCR技術(shù)及PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)構(gòu)建了絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因（STPK）和己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的敲除株；利用Split-Marker重組技術(shù)和PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得了兩個(gè)交配性基因的敲除株；利用酶切和連接方法結(jié)合根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得了絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（STE）基因和自然抗性相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白基因的敲除株；利用吡啶硫胺素作為第二抗性構(gòu)建了上述6株基因敲除株對(duì)應(yīng)的回復(fù)突變株。構(gòu)建的雙相型轉(zhuǎn)換相關(guān)基因敲除株和回復(fù)突變株，將為解析這些基因功能和闡明雙相型轉(zhuǎn)換相關(guān)機(jī)制提供材料保障，多種方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)申克孢子絲菌進(jìn)行基因敲除為研究其他真菌提供技術(shù)支撐。 4.雙相型轉(zhuǎn)換相關(guān)基因功能研究 對(duì)基因敲除株的形態(tài)學(xué)改變、藥物敏感性改變、細(xì)胞組成成分改變及致病力改變進(jìn)行研究。六株菌的的形態(tài)均有不同程度的改變，主要變化為菌落顏色改變、分生孢子產(chǎn)生減少、菌落酵母相形成障礙等方面；六株菌的對(duì)藥物的普遍抵抗能力均有所下降；細(xì)胞組分有不同程度增加；菌株的致病力均有不同程度的降低。上述結(jié)果表明申克孢子絲菌雙相型轉(zhuǎn)換是由多種原因引起的，解析相關(guān)基因功能，明確相關(guān)作用機(jī)制將為雙相型真菌的形態(tài)轉(zhuǎn)換、致病機(jī)制及感染的防治等研究提供參考和根據(jù)。 綜上，本研究建立了系統(tǒng)性孢子絲菌病分離株申克孢子絲菌IFM41598容量為3000株的小規(guī)模T-DNA隨機(jī)插入突變體庫(kù)，篩選并鑒定了6個(gè)雙相型轉(zhuǎn)換相關(guān)基因，構(gòu)建了這些基因的敲除株和回復(fù)突變株，初步解析了基因功能，為深入解析病原真菌的基因功能、探討致病機(jī)制、抗真菌藥物的研發(fā)奠定基礎(chǔ)，對(duì)于其它真菌的研究，亦能提供有價(jià)值的參考資料。
【關(guān)鍵詞】：申克孢子絲菌 雙相型轉(zhuǎn)換 基因 基因敲除 同源重組
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R379
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-9
• 目錄9-13
• 第1章 緒論13-23
• 1.1 申克孢子絲菌與孢子絲菌病13-14
• 1.2 雙相型真菌和雙相型轉(zhuǎn)換14-18
• 1.3 絲狀真菌的基因敲除技術(shù)18-21
• 1.4 本研究的立題依據(jù)、研究?jī)?nèi)容及意義21-23
• 第2章 雙相型轉(zhuǎn)換相關(guān)基因篩選與鑒定23-39
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料23-24
• 2.2 主要試劑和培養(yǎng)基配制24-26
• 2.3 主要引物26-27
• 2.4 實(shí)驗(yàn)方法27-31
• 2.5 結(jié)果31-36
• 2.6 討論36-39
• 第3章 申克孢子絲菌雙相型轉(zhuǎn)換相關(guān)基因的定向敲除39-72
• 3.0 實(shí)驗(yàn)材料39-43
• 3.1 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的 Nramp 基因和 STE 基因的定向敲除43-51
• 3.2 Overlap -PCR 介導(dǎo)的 MFS 基因和 STPK 基因的定向敲除51-56
• 3.3 Split-Marker 技術(shù)介導(dǎo)的 MAT1 基因和 MAT2 基因定向敲除56-58
• 3.4 回復(fù)突變株的構(gòu)建58-61
• 3.5 結(jié)果61-70
• 3.6 討論70-72
• 第4章 雙相型轉(zhuǎn)換相關(guān)基因功能和作用機(jī)制研究72-88
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料72-73
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法73-77
• 4.3 結(jié)果77-86
• 4.4 討論86-88
• 第5章 結(jié)論88-89
• 參考文獻(xiàn)89-98
• 作者簡(jiǎn)介及在學(xué)期間取得科研成果98-101
• 致謝101-102

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 陳敏;廖萬(wàn)清;;孢子絲菌病的治療[J];皮膚病與性病;2010年03期

2 陳裕充;;孢子絲菌病[J];中國(guó)真菌學(xué)雜志;2008年04期

3 萬(wàn)雪;賀丹;王麗;;申克孢子絲菌毒力因子及宿主抗感染免疫的研究進(jìn)展[J];中國(guó)真菌學(xué)雜志;2013年05期

  本文關(guān)鍵詞：申克孢子絲菌雙相型轉(zhuǎn)換相關(guān)基因功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：358606