本文關鍵詞：曲霉中鈣信號系統(tǒng)調控應答唑類藥物的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：曲霉是自然界中分布極為廣泛的絲狀真菌。在醫(yī)學界,隨著高效廣譜抗生素的廣泛應用、抗腫瘤治療的深入開展,器官移植和外科其他介入性治療的不斷應用,侵襲性曲霉感染的發(fā)生呈現(xiàn)上升趨勢。而在各種曲霉感染的藥物治療方面,與日新月異、種類繁多的其他抗菌藥相比,抗真菌藥物研究進展緩慢。 目前治療深度曲霉感染的臨床一線藥物主要是伊曲康唑(ITZ)和伏立康唑(VRC)。然而,已經發(fā)現(xiàn)越來越多的臨床分離菌對唑類藥物產生耐藥性。目前國際上公認的真菌抗藥性產生的可能機理和途徑,有的真菌細胞會啟動多藥抗性蛋白PDR的表達并行使功能,將唑類藥物(azole)作為底物泵出胞外；還有的真菌細胞會通過改變藥靶——麥角固醇的合成,減少唑類藥物毒害。除了以上兩種傳統(tǒng)的機制以外,現(xiàn)在越來越多的研究表明當真菌處在有唑類藥物的環(huán)境中時,藥物通過對細胞膜施壓從而激活真菌細胞逆境響應途徑。 之前的研究發(fā)現(xiàn)Ca2+作為細胞信使的基礎,通過改變胞漿Ca2+與胞內鈣庫或胞外Ca2+之間的濃度梯度來影響各種生理活動,包括生長、發(fā)育、增殖、分泌、物質運輸以及逆境響應等,而傳遞這種信號依靠鈣離子通道或者鈣離子的轉運子、胞內鈣離子受體以及下游靶蛋白組成的鈣信號系統(tǒng)。于是本文深入探究了鈣信號系統(tǒng)與曲霉藥物應答的關系。 我們分別利用模式真菌構巢曲霉和煙曲霉作為研究材料,采用胞外鈣離子信號阻斷劑EGTA、及鈣信號系統(tǒng)重要蛋白的缺失菌株背景條件下,測試曲霉對藥物的敏感性。正如我們預測,鈣離子螯合劑2mM EGTA分別和次抑菌濃度的ITZ (0.1μ g/ml)、VRC(0.12μg/ml)共給藥可以明顯抑制曲霉生長。用E-test法測得加入2mM EGTA后,ITZ對構巢曲霉的抑菌濃度從1.5μg/ml降低至0.75μg/ml。缺失鈣信號系統(tǒng)的重要蛋白calcineurin (CnaA)或下游轉錄因子CrzA時,構巢曲霉對唑類藥物超敏感,然而當缺失鈣離子通道蛋白MidA、CchA時,構巢曲霉對唑類藥物的敏感性降低。我們進一步探究Ca2+信號途徑中各組分是如何影響曲霉對唑類藥物的敏感性。我們用Rh123模擬藥物作為藥物外排泵底物,通過流式細胞儀測熒光亮度,發(fā)現(xiàn)調節(jié)Ca2+濃度(加入2mM EGTA),可以調節(jié)藥物外排泵的活性,使得胞內熒光亮度增加1倍；通過HPLC的方法測定提取出的Ca2+信號途徑中重要蛋白缺失菌株中的麥角固醇的含量。我們發(fā)現(xiàn)在敲除了鈣信號系統(tǒng)的重要蛋白calcineurin (CnaA)時,其中的麥角固醇含量相對野生型降低至88.6%,而敲除了鈣離子通道蛋白MidA、CchA時,其中的麥角固醇含量相對野生型增加了7%。進而我們以條件致病菌——煙曲霉作為材料,鈣離子螯合劑5mM EGTA分別和次抑菌濃度的ITZ (0.7μg/ml)、VRC(0.72μg/ml)共給藥可以明顯抑制煙曲霉生長,說明Ca2+信號途徑也調節(jié)了煙曲霉對唑類藥物的敏感性�；诖�,我們進一步利用大蠟螟做活體實驗證明EGTA和唑類藥物聯(lián)用比唑類藥物單用更好的治療煙曲霉感染,可以延緩感染煙曲霉的大蠟螟的死亡速率。 綜上所述,鈣離子通過影響藥物外排泵的活力,調節(jié)曲霉對唑類藥物的敏感性；鈣信號系統(tǒng)主要蛋白通過影響唑類藥物藥靶——麥角固醇的合成,調節(jié)曲霉對唑類藥物的敏感性；將機制研究的成果應用于實踐,治療煙曲霉感染的大蠟螟時,鈣離子螯合劑和唑類藥物聯(lián)合效果好于唑類藥物單用。 本研究成果意義在于可以采用鈣信號系統(tǒng)的阻斷劑或抑制劑和目前抗真菌臨床一線藥物-唑類藥聯(lián)合使用來對付臨床上出現(xiàn)的耐藥菌株。因此,將為控制真菌的耐藥性和改進現(xiàn)有的治療策略提供新思路。
【關鍵詞】：鈣信號通路 唑類藥物 藥物外排泵 EGTA 構巢曲霉 麥角固醇合成 大蠟螟
【學位授予單位】：南京師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R379.6;R96
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 第一章 綜述10-25
• 1 抗真菌藥物及真菌藥物耐受性概述10-13
• 1.1 真菌病現(xiàn)狀概述10
• 1.2 抗真菌藥物研究概述10-12
• 1.2.1 以細胞壁組分D-β-1,3-葡聚糖的生物合成作為設計靶點11
• 1.2.2 以細胞壁組分幾丁質的生物合成作為設計靶點11
• 1.2.3 以細胞膜組分麥角固醇作為設計靶點11
• 1.2.4 以細胞膜組分麥角固醇合成途徑作為設計靶點11
• 1.2.5 以致病菌DNA、RNA的合成作為設計靶點11-12
• 1.2.6 有潛力成為抗真菌藥物的研究12
• 1.3 真菌耐藥性研究概述12-13
• 2 鈣信號通路13-20
• 2.1 鈣離子14-15
• 2.2 鈣離子通道蛋白MidA和CchA15-16
• 2.3 鈣離子結合蛋白CAM16-17
• 2.4 CaM激酶CnaA17-19
• 2.5 CnaA調控的轉錄因子CrzA19-20
• 3 模式生物構巢曲霉ASPERGILLUS NIDULANS20-23
• 4 本課題的研究內容、思路及方法23-25
• 4.1 研究內容23
• 4.2 研究思路與研究方法23-25
• 第二章 參與調控真菌多藥抗性(PLEIOTROPIC DRUG RESISTANCE,P D R)的分子結構的信息學及系統(tǒng)學分析25-31
• 1 方法25-26
• 1.1 構建多物種N-J樹25-26
• 1.2 統(tǒng)計每兩種物種PDR的同源性26
• 1.3 分析各物種PDR蛋白的結構26
• 2 結果26-29
• 2.1 進化分析各物種中PDR蛋白親緣關系26-28
• 2.2 PDR蛋白結構分析28-29
• 3 討論29-30
• 3.1 真菌的多藥抗性29
• 3.2 真菌中ABC超家族的系統(tǒng)進化關系29-30
• 4 結語30-31
• 第三章 構巢曲霉鈣信號系統(tǒng)主要元件參與藥物應答的研究31-46
• 1 材料與方法31-36
• 1.1 菌種及培養(yǎng)條件31-32
• 1.2 主要試劑及來源32
• 1.3 所用藥物32-33
• 1.4 主要儀器設備及來源33
• 1.5 方法33-36
• 1.5.1 固體瓊脂稀釋法測定菌株對于藥物的敏感性33-34
• 1.5.2 肉湯稀釋法測試菌株對于藥物的敏感性34
• 1.5.3 E-test實驗測試菌株對于藥物的敏感性34
• 1.5.4 絲狀真菌體外MIC測試(參考CLSI-M38-A2)34-35
• 1.5.5 A.nidulans基因組DNA的提取35
• 1.5.6 alcA(p)：：GFP-pmrA同源整合菌株的構建35
• 1.5.7 原生質體的制備與轉化35-36
• 1.5.8 重組子(發(fā)生Gene Replacement的轉化子)的初步篩選36
• 1.5.9 重組子的進一步PCR鑒定36
• 2 實驗結果36-44
• 2.1 胞外鈣離子影響構巢曲霉野生型菌株對唑類藥物的敏感性36-40
• 2.1.1 固體培養(yǎng)條件下野生型菌株在胞外鈣離子濃度變化后對唑類藥物的敏感性36-38
• 2.1.2 液體培養(yǎng)條件下野生型菌株在胞外鈣離子濃度變化后對唑類藥物的敏感性38-39
• 2.1.3 E-test實驗測定菌株對唑類藥物的敏感性39
• 2.1.4 體外MIC實驗測定菌株對唑類藥物的敏感性39-40
• 2.2 鈣信號系統(tǒng)重要蛋白調控構巢曲霉對唑類藥物的敏感性40-44
• 2.2.1 鈣信號系統(tǒng)核心蛋白突變株對唑類藥物的敏感性40-41
• 2.2.2 鈣信號系統(tǒng)中鈣通道蛋白缺失菌株對唑類藥物的敏感性41-42
• 2.2.5 鈣信號系統(tǒng)下游靶蛋白突變株對唑類藥物的敏感性42-44
• 3 討論44-46
• 第四章 鈣信號系統(tǒng)調節(jié)構巢曲霉對唑類藥物敏感性的機制研究46-58
• 1 材料與方法47-51
• 1.1 菌種及培養(yǎng)條件47
• 1.2 試劑與儀器47-48
• 1.3 方法48-51
• 1.3.1 菌液制備與染料負載48
• 1.3.2 流式細胞儀測定胞內Rhodamine 123的積累量48
• 1.3.3 胞內鈣離子濃度測定菌液制備與染料負載48
• 1.3.4 激光共聚焦測定細胞內鈣離子濃度變化48
• 1.3.5 菌絲體麥角固醇的抽提48-49
• 1.3.6 實時熒光定量PCR測定構巢曲霉野生型在唑類藥物刺激時鈣信號系統(tǒng)主要蛋白及藥物外排泵基因的表達量49-51
• 2 結果51-56
• 2.1 加入EGTA后,胞內Rhodamine 123的積累量51-52
• 2.2 EGTA的加入會引起胞內鈣離子濃度的降低52-53
• 2.3 鈣信號系統(tǒng)主要蛋白缺失菌株胞內Rhodamine 123的積累量53-54
• 2.4 韓信號系統(tǒng)主要蛋白在噸類藥物刺激下基因表達量的變化54-55
• 2.5 鈣信號系統(tǒng)主要蛋白缺失菌株細胞膜組分麥角固醇含量測定55-56
• 3 討論56-58
• 第五章 鈣信號系統(tǒng)調節(jié)煙曲霉對唑類藥物的敏感性且EGTA和唑類藥物聯(lián)用模式在活體中可以發(fā)揮作用58-63
• 1 材料與方法58-59
• 1.1 菌種及培養(yǎng)條件58
• 1.2 主要試劑及來源58-59
• 1.3 主要儀器設備及來源59
• 1.4 方法59
• 1.4.1 固體平板稀釋法測試煙曲霉對唑類藥物的敏感性59
• 1.4.2 E-test實驗測試煙曲霉對于藥物的敏感性59
• 1.4.3 大蠟螟(Galleria mellonella)侵染實驗59
• 2 結果59-62
• 2.1 在固體培養(yǎng)條件下測定煙曲霉對唑類藥物的敏感性59-60
• 2.2 E-test實驗測定菌株對唑類藥物的敏感性60-61
• 2.3 大蠟螟(Galleria mellonella)侵染實驗61-62
• 3 討論62-63
• 第六章 結論63-65
• 致謝65-66
• 參考文獻66-72

【共引文獻】

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本文編號：355894