本文關(guān)鍵詞：RNA氧化損傷檢測方法優(yōu)化及不同條件下細(xì)胞RNA氧化損傷分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：RNA是細(xì)胞內(nèi)廣泛分布的一類生物大分子，在基因表達(dá)調(diào)控、蛋白質(zhì)翻譯等方面發(fā)揮重要作用。研究表明在生理和病理條件下都存在RNA損傷，但卻一直沒有得到足夠重視，致使RNA損傷對細(xì)胞和機體造成的毒害作用被低估。最近有研究表明RNA損傷可能參與神經(jīng)退行性疾病等多種疾病的發(fā)生和發(fā)展，因此對RNA損傷的認(rèn)識和研究將有助于對疾病發(fā)生機制的理解，并進一步為相關(guān)疾病的診斷和治療提供理論基礎(chǔ)和方法。本研究旨在建立并優(yōu)化細(xì)胞RNA氧化損傷的檢測方法，分析不同條件下細(xì)胞和組織的RNA損傷狀況，并探索毛細(xì)血管擴張性共濟失調(diào)征突變蛋白（ATM）在RNA損傷識別和修復(fù)機制中的作用。方法:反轉(zhuǎn)錄阻斷聯(lián)合雙引物擴增法：用過氧化氫（H2O2）處理非細(xì)胞體系和細(xì)胞體系RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)所檢測mRNA的5'端和3'端各設(shè)計一對引物，進行實時定量PCR，比較兩端PCR產(chǎn)物相對含量判斷RNA氧化損傷程度，損傷越嚴(yán)重則反轉(zhuǎn)錄生成完整cDNA的效率越低，相應(yīng)包含mRNA5'端的cDNA含量越少。競爭性酶聯(lián)免疫法（ELISA）：以RNA主要氧化損傷產(chǎn)物8-羥基鳥嘌呤（8-OHG）作為競爭性抗原包被于酶標(biāo)板內(nèi)，與RNA損傷樣品競爭性結(jié)合特異性抗體，通過測量酶標(biāo)板內(nèi)各孔OD450判斷RNA損傷狀況。采用ELISA方法檢測ATM野生型和突變型細(xì)胞RNA氧化損傷；將非氧化和H2O2氧化處理的RNA轉(zhuǎn)染人胚腎293細(xì)胞，用Western blotting檢測ATM磷酸化及蛋白表達(dá)水平變化。結(jié)果:以管家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）和p53mRNA為檢測對象，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄阻斷聯(lián)合雙引物擴增法檢測出非細(xì)胞體系和細(xì)胞體系氧化處理組mRNA損傷程度均明顯高于對照組，且隨著氧化劑H2O2濃度增加損傷增強，同時一定限度內(nèi)降低反轉(zhuǎn)錄酶用量能提高檢測靈敏度。競爭性ELISA法檢測到癌與癌旁組織、細(xì)胞衰老模型中存在氧化損傷RNA；同時檢測出HeLa細(xì)胞經(jīng)電離輻射后產(chǎn)生RNA氧化損傷，且損傷程度與輻射劑量成正相關(guān)。ATM突變型細(xì)胞較野生型細(xì)胞其RNA對氧化應(yīng)激敏感；轉(zhuǎn)染氧化RNA后ATM被激活，，提示ATM可能參與RNA氧化損傷應(yīng)答。結(jié)論:本研究建立并優(yōu)化了兩種RNA損傷檢測方法，成功用于分析不同條件下細(xì)胞和組織的RNA氧化損傷狀況，為深入研究RNA氧化損傷在相關(guān)疾病中的作用機制提供了方法。本研究初步證實了DNA損傷應(yīng)激關(guān)鍵分子ATM參與RNA氧化損傷過程，但具體分子機制尚待進一步研究。
【關(guān)鍵詞】：RNA氧化損傷 8-OHG GAPDH p53 ATM
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R3416
【目錄】：

• 縮略語5-7
• 中文摘要7-9
• Abstract9-11
• 1.引言11-20
• 1.1 RNA 損傷研究意義及背景12-15
• 1.2 RNA 氧化損傷分析方法15-17
• 1.3 RNA 氧化損傷生物學(xué)機制17-20
• 2. 材料與方法20-28
• 2.1 實驗材料20-24
• 2.2 實驗方法24-28
• 3. 實驗結(jié)果28-38
• 3.1 建立并優(yōu)化反轉(zhuǎn)錄阻斷聯(lián)合雙引物擴增檢測 RNA 氧化損傷方法28-30
• 3.2 建立并優(yōu)化競爭性 ELISA 檢測 8-OHG 方法30-32
• 3.3 分析不同條件下細(xì)胞 RNA 氧化損傷32-36
• 3.4 ATM 與細(xì)胞 RNA 氧化損傷相關(guān)性36-38
• 4. 討論38-42
• 5. 總結(jié)42-44
• 參考文獻44-48
• 附錄48-50
• 致謝50-51
• 綜述51-58
• 參考文獻57-58

【共引文獻】

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本文編號：354325