本文關(guān)鍵詞：TNFR1的內(nèi)化與脂筏關(guān)系的探討，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：脂筏和小窩是質(zhì)膜上富含膽固醇和鞘磷脂的微結(jié)構(gòu)域，在啟動(dòng)許多信號(hào)通路中起到很重要的作用。小窩在質(zhì)膜上形如瓶頸形凹陷，是脂筏的一個(gè)子集。 內(nèi)化作用可在細(xì)胞內(nèi)體表面募集信號(hào)分子并激活相應(yīng)的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)來啟動(dòng)信號(hào)通路[1-3]。受體和配體可以通過多種途徑從細(xì)胞表面發(fā)生內(nèi)化。其中最主要的是網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)化作用，除此之外，脂筏也能介導(dǎo)內(nèi)化作用[4,5]。 大量研究證實(shí)sTNF-α通過TNFR1既可以活化NF-κB，促進(jìn)細(xì)胞生存，又可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而后者依賴于受體內(nèi)化,在胞漿形成DISC信號(hào)復(fù)合物。本室前期工作發(fā)現(xiàn)，用MCD破壞Hela細(xì)胞的脂筏，，可以顯著增強(qiáng)sTNF-α的細(xì)胞毒效應(yīng)（p0.01）。我們推測破壞脂筏可能通過促進(jìn)TNFR1內(nèi)化，抑制了生存信號(hào)NF-κB的活化，促進(jìn)DISC的形成，從而增強(qiáng)sTNF-α介導(dǎo)的殺傷效應(yīng)。本研究主要探討脂筏與TNFR1內(nèi)化的關(guān)系，其主要結(jié)果如下： 一、確定MCD作用的最佳濃度 1.結(jié)合前期試驗(yàn)和相關(guān)文獻(xiàn)，測定不同時(shí)間點(diǎn)及不同濃度的MCD對(duì)細(xì)胞的胞毒效應(yīng)，確定在45min時(shí)，7.5mM及以下濃度的MCD對(duì)細(xì)胞毒性小。 2.前期試驗(yàn)證明，破壞脂筏可降低細(xì)胞的粘附能力。同質(zhì)粘附實(shí)驗(yàn)證實(shí)，5mM及以上濃度的MCD能顯著降低細(xì)胞的粘附現(xiàn)象。 故以下實(shí)驗(yàn)采用MCD濃度為5mM，作用時(shí)間為45min。 二、破壞脂筏可增強(qiáng)sTNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷和凋亡 1.將野生型TNFR1和內(nèi)化缺陷的突變體TNFR1-Y236A轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，結(jié)果證實(shí)用MCD破壞脂筏，sTNF-α對(duì)轉(zhuǎn)染野生型TNFR1靶細(xì)胞的胞毒效應(yīng)升高了18.7%（p0.05），而對(duì)轉(zhuǎn)染TNFR1-Y236A細(xì)胞的胞毒效應(yīng)則無明顯影響。提示MCD有可能通過影響TNFR1內(nèi)化來影響靶細(xì)胞對(duì)sTNF-α的應(yīng)答。 2.用MCD破壞高表達(dá)TNFR1的Hela細(xì)胞的脂筏，不但可促進(jìn)sTNF-α介導(dǎo)的胞毒效應(yīng)，且可提高sTNF-α誘導(dǎo)的caspase-8和caspase-3的活化，提示破壞脂筏可明顯促進(jìn)sTNF-α介導(dǎo)的凋亡。 三、破壞脂筏減少表達(dá)在細(xì)胞表面的TNFR1 用MCD破壞Hela細(xì)胞的脂筏，用流式細(xì)胞術(shù)檢測sTNF-α刺激后，靶細(xì)胞表面TNFR1的表達(dá)率。結(jié)果顯示，脂筏的破壞使膜表面TNFR1的表達(dá)率下降了13.17%（p0.05）,而Western blot顯示MCD并不影響細(xì)胞內(nèi)TNFR1的總表達(dá)量。提示脂筏破壞可能促進(jìn)sTNF-α介導(dǎo)的TNFR1內(nèi)化。 四、構(gòu)建定位于脂筏內(nèi)的TNFR1突變體 正常情況下，TNFR1部分在脂筏內(nèi)，部分在脂筏外。為使所有TNFR1定位在脂筏內(nèi)，我們通過重迭PCR將駐留于脂筏內(nèi)的caveolin1脂筏定位結(jié)構(gòu)域(301-378)連接到TNFR1胞內(nèi)內(nèi)化結(jié)構(gòu)域(1-729)。突變體命名為TNFR1-CAV，將其連接到N1-EGFP質(zhì)粒上，并瞬轉(zhuǎn)293T細(xì)胞，其表達(dá)效率達(dá)到62.4%時(shí)，提取脂筏，通過抗TNFR1抗體和GFP抗體，均證實(shí)TNFR1-CAV－GFP融合蛋白全部定位在脂筏層中。 五、激光共聚焦掃描顯微鏡觀察TNFR1及其幾種突變體的內(nèi)化 分別對(duì)293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染標(biāo)記了GFP的TNFR1，TNFR1-Y236A，TNFR1-ΔDD，TNFR1-CAV，在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)破壞脂筏可明顯促進(jìn)sTNF-α誘導(dǎo)的野生型和缺失DD的TNFR1的內(nèi)化，但缺失內(nèi)化結(jié)構(gòu)域的TNFR1則在任何刺激下不發(fā)生內(nèi)化。有意思的是sTNF-α不能誘導(dǎo)所有定位于脂筏內(nèi)的TNFR1-CAV發(fā)生內(nèi)化，但用MCD破壞脂筏后，這種配體誘導(dǎo)的受體內(nèi)化則重新出現(xiàn)，提示脂筏能夠保護(hù)TNFR1不內(nèi)化。 綜上所述，本研究證實(shí)脂筏可通過干擾受體內(nèi)化而參與決定靶細(xì)胞對(duì)sTNF-α的應(yīng)答，凋亡還是存活？故以脂筏為靶點(diǎn)，可能改變靶細(xì)胞例如腫瘤細(xì)胞對(duì)某些因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，為臨床治療相關(guān)疾病提供新的思路。
【關(guān)鍵詞】：TNFR1 sTNF-α 內(nèi)化 脂筏 凋亡
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R363
【目錄】：

• 英文縮略詞表5-7
• 中文摘要7-9
• Abstract9-12
• 前言12-15
• 材料和方法15-31
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果31-44
• 討論44-47
• 小結(jié)47-48
• 參考文獻(xiàn)48-53
• 綜述53-69
• 參考文獻(xiàn)62-69
• 致謝69

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：353573