目的： 結(jié)核桿菌熱休克蛋白70（Heat shock protein 70，HSP70）具有載體分子效應(yīng)和 免疫佐劑的生物學(xué)功能，將結(jié)核桿菌HSP70基因與乙肝病毒表面抗原（HBsAg） 基因融合，構(gòu)建融合乙型肝炎DNA疫苗，并進(jìn)一步研究融合乙肝DNA疫苗在小 鼠體內(nèi)誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答的效果，旨在通過基因融合技術(shù)提高乙肝 DNA疫苗的免疫效果，并為進(jìn)一步探索乙肝治療性疫苗和融合蛋白疫苗打基礎(chǔ)。 方法： 1．HSP70真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定：用PCR的方法從結(jié)核桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H₃₇Rv 基因組中擴(kuò)增出HSP70基因，經(jīng)A-T克隆入質(zhì)粒pGEM-T vector，構(gòu)建成重組 質(zhì)粒pGEM-HSP70，經(jīng)酶切鑒定和DNA序列測定證實(shí)目的基因無誤后，亞克 隆到質(zhì)粒pcDNA3.1（+），構(gòu)建成真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-HSP70。 2．HBsAg及其與熱休克蛋白70融合表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定：用PCR方法和基因 克隆技術(shù)，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pCI-S（含HBsAg主蛋白基因全序列）、重組質(zhì)粒 pCI-HSP70（含HSP70基因全...

【文章來源】： 重慶醫(yī)科大學(xué)重慶市

【文章頁數(shù)】：105 頁

【文章目錄】：
符號(hào)說明
中文摘要
英文摘要
前言
    第一部分： 結(jié)核桿菌HSP70真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定
        實(shí)驗(yàn)材料
        實(shí)驗(yàn)方法
        實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    第二部分： HBsAg及其與結(jié)核桿菌HSP70融合表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定
        實(shí)驗(yàn)材料
        實(shí)驗(yàn)方法
        實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    第三部分： HBsAg及其與結(jié)核桿菌HSP70融合表達(dá)質(zhì)粒在真核細(xì)胞中的表達(dá)
        實(shí)驗(yàn)材料
        實(shí)驗(yàn)方法
            1. 質(zhì)粒的大量提取
            2. 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞（或COS-7細(xì)胞）
            3. HapG2細(xì)胞總RNA的提取
            4. RT-PCR檢測目的基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)
            5. 免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測HBsAg的表達(dá)
            6. ELISA檢測HBsAg的表達(dá)
        實(shí)驗(yàn)結(jié)果
            1. 目的基因在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的RT-PCR檢測結(jié)果
            2. 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測結(jié)果
            3. 重組質(zhì)粒在HepG2細(xì)胞和COS-7細(xì)胞中的表達(dá)
    第四部分： HBsAg及其與結(jié)核桿菌HSP70融合表達(dá)質(zhì)粒DNA免疫小鼠誘導(dǎo)其產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答
        實(shí)驗(yàn)材料
        實(shí)驗(yàn)方法
            1. 質(zhì)粒大量提取和定量
            2. 質(zhì)粒DNA免疫小鼠
            3. 抗-HBs抗體檢測方法
            4. 免疫小鼠脾細(xì)胞的制備
            5. 免疫小鼠脾細(xì)胞HBsAg特異性CTL的檢測（LDH釋放法）
            6. 免疫小鼠脾細(xì)胞IL-2、IFN-γ、IL-4分泌的檢測
        實(shí)驗(yàn)結(jié)果
            1. 質(zhì)粒純度和含量測定結(jié)果
            2. 免疫小鼠抗-HBs抗體反應(yīng)檢測結(jié)果
            3. 質(zhì)粒DNA免疫小鼠HBsAg特異性CTL活性
            4. 質(zhì)粒DNA免疫小鼠脾細(xì)胞體外誘導(dǎo)IL-2的分泌水平
            5. 質(zhì)粒DNA免疫小鼠脾細(xì)胞體外誘導(dǎo)IFN-γ的分泌水平
            6. 質(zhì)粒DNA免疫小鼠脾細(xì)胞體外誘導(dǎo)IL-4的分泌水平
討論
參考文獻(xiàn)
結(jié)論
本課題的創(chuàng)新點(diǎn)
文獻(xiàn)綜述1： 乙型肝炎核酸疫苗的研究進(jìn)展
文獻(xiàn)綜述2： 分枝桿菌熱休克蛋白的載體分子效應(yīng)
致謝
攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及參加學(xué)術(shù)會(huì)議


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[2]HBV和HCV核酸疫苗的臨床應(yīng)用前景 [J]. 陳智.  中華肝臟病雜志. 2000(06)
[3]乙型肝炎病毒S基因單獨(dú)和聯(lián)合白細(xì)胞介素-12誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答 [J]. 趙鴻,成軍,斯崇文.  中華傳染病雜志. 2000(03)
[4]6種真核表達(dá)質(zhì)粒作為HBV-DNA疫苗免疫小鼠的研究 [J]. 葉珈,任紅,古柏燕,陶小紅.  中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志. 2000(04)
[5]慢性乙型肝炎治療的新突破 [J]. 姚光弼.  肝臟. 1999(04)
[6]HBsAg在不同真核表達(dá)載體中的表達(dá) [J]. 古柏燕,任紅.  中華肝臟病雜志. 1999(02)
[7]細(xì)胞因子對(duì)乙肝病毒基因疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體的影響 [J]. 張彤,張光磊,阮麗榮,張紹祖.  中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志. 1997(06)



本文編號(hào)：3533277