發(fā)布時間：2021-12-10 19:45

　　目的： 結核桿菌熱休克蛋白70（Heat shock protein 70，HSP70）具有載體分子效應和 免疫佐劑的生物學功能，將結核桿菌HSP70基因與乙肝病毒表面抗原（HBsAg） 基因融合，構建融合乙型肝炎DNA疫苗，并進一步研究融合乙肝DNA疫苗在小 鼠體內(nèi)誘導體液免疫和細胞免疫應答的效果，旨在通過基因融合技術提高乙肝 DNA疫苗的免疫效果，并為進一步探索乙肝治療性疫苗和融合蛋白疫苗打基礎。 方法： 1．HSP70真核表達質(zhì)粒的構建和鑒定：用PCR的方法從結核桿菌標準株H₃₇Rv 基因組中擴增出HSP70基因，經(jīng)A-T克隆入質(zhì)粒pGEM-T vector，構建成重組 質(zhì)粒pGEM-HSP70，經(jīng)酶切鑒定和DNA序列測定證實目的基因無誤后，亞克 隆到質(zhì)粒pcDNA3.1（+），構建成真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-HSP70。 2．HBsAg及其與熱休克蛋白70融合表達質(zhì)粒的構建和鑒定：用PCR方法和基因 克隆技術，構建成重組質(zhì)粒pCI-S（含HBsAg主蛋白基因全序列）、重組質(zhì)粒 pCI-HSP70（含HSP70基因全...

【文章來源】： 重慶醫(yī)科大學重慶市

【文章頁數(shù)】：105 頁

【文章目錄】：
符號說明
中文摘要
英文摘要
前言
    第一部分： 結核桿菌HSP70真核表達質(zhì)粒的構建和鑒定
        實驗材料
        實驗方法
        實驗結果
    第二部分： HBsAg及其與結核桿菌HSP70融合表達質(zhì)粒的構建和鑒定
        實驗材料
        實驗方法
        實驗結果
    第三部分： HBsAg及其與結核桿菌HSP70融合表達質(zhì)粒在真核細胞中的表達
        實驗材料
        實驗方法
            1. 質(zhì)粒的大量提取
            2. 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細胞（或COS-7細胞）
            3. HapG2細胞總RNA的提取
            4. RT-PCR檢測目的基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達
            5. 免疫細胞化學方法檢測HBsAg的表達
            6. ELISA檢測HBsAg的表達
        實驗結果
            1. 目的基因在轉(zhuǎn)錄水平表達的RT-PCR檢測結果
            2. 免疫細胞化學檢測結果
            3. 重組質(zhì)粒在HepG2細胞和COS-7細胞中的表達
    第四部分： HBsAg及其與結核桿菌HSP70融合表達質(zhì)粒DNA免疫小鼠誘導其產(chǎn)生特異性免疫應答
        實驗材料
        實驗方法
            1. 質(zhì)粒大量提取和定量
            2. 質(zhì)粒DNA免疫小鼠
            3. 抗-HBs抗體檢測方法
            4. 免疫小鼠脾細胞的制備
            5. 免疫小鼠脾細胞HBsAg特異性CTL的檢測（LDH釋放法）
            6. 免疫小鼠脾細胞IL-2、IFN-γ、IL-4分泌的檢測
        實驗結果
            1. 質(zhì)粒純度和含量測定結果
            2. 免疫小鼠抗-HBs抗體反應檢測結果
            3. 質(zhì)粒DNA免疫小鼠HBsAg特異性CTL活性
            4. 質(zhì)粒DNA免疫小鼠脾細胞體外誘導IL-2的分泌水平
            5. 質(zhì)粒DNA免疫小鼠脾細胞體外誘導IFN-γ的分泌水平
            6. 質(zhì)粒DNA免疫小鼠脾細胞體外誘導IL-4的分泌水平
討論
參考文獻
結論
本課題的創(chuàng)新點
文獻綜述1： 乙型肝炎核酸疫苗的研究進展
文獻綜述2： 分枝桿菌熱休克蛋白的載體分子效應
致謝
攻讀博士學位期間發(fā)表的學術論文及參加學術會議


【參考文獻】：
期刊論文
[1]HBsAg真核表達重組質(zhì)粒在EB病毒轉(zhuǎn)化B淋巴母細胞中的表達 [J]. 梁增偉,李用國,蘭英華,任紅.  中華肝臟病雜志. 2001(05)
[2]HBV和HCV核酸疫苗的臨床應用前景 [J]. 陳智.  中華肝臟病雜志. 2000(06)
[3]乙型肝炎病毒S基因單獨和聯(lián)合白細胞介素-12誘導小鼠產(chǎn)生特異性免疫應答 [J]. 趙鴻,成軍,斯崇文.  中華傳染病雜志. 2000(03)
[4]6種真核表達質(zhì)粒作為HBV-DNA疫苗免疫小鼠的研究 [J]. 葉珈,任紅,古柏燕,陶小紅.  中華微生物學和免疫學雜志. 2000(04)
[5]慢性乙型肝炎治療的新突破 [J]. 姚光弼.  肝臟. 1999(04)
[6]HBsAg在不同真核表達載體中的表達 [J]. 古柏燕,任紅.  中華肝臟病雜志. 1999(02)
[7]細胞因子對乙肝病毒基因疫苗誘導產(chǎn)生抗體的影響 [J]. 張彤,張光磊,阮麗榮,張紹祖.  中華微生物學和免疫學雜志. 1997(06)



本文編號：3533277