本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)錄因子FOXM1的核酸適配體篩選與應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：人類FOXM1蛋白屬于Forkhead Box（Fox）轉(zhuǎn)錄因子家族，到目前為止這個(gè)家族在人類基因組中擁有至少50個(gè)成員，分別參與調(diào)節(jié)了細(xì)胞的分化、增殖、代謝與凋亡等生理過程，同時(shí)還對腫瘤發(fā)生和發(fā)展具有重要意義。FOXM1是一個(gè)與細(xì)胞增殖相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，它被發(fā)現(xiàn)在人類的多種腫瘤細(xì)胞中都存在較高的表達(dá)水平，表明FOXM1與多種癌癥的發(fā)生密切相關(guān)，如肝癌、肺癌、前列腺癌和乳腺癌等。因此，對FOXM1的深入研究將有助于進(jìn)一步揭示腫瘤發(fā)生的發(fā)病機(jī)理，并為抗腫瘤藥物的研發(fā)提供可能的新靶點(diǎn)。 針對蛋白功能研究，目前傳統(tǒng)方法多采用抗體免疫手段。近年來核酸適配體在生物分析、疾病診斷、治療、藥物篩選等方面的應(yīng)用引起了人們極大的興趣，以核酸適配體取代抗體利用ELISA和流式細(xì)胞技術(shù)檢測蛋白質(zhì)的表達(dá)，可以比使用抗體獲得更高的靈敏度。同時(shí)核酸適配體可以通過核酸化學(xué)方法進(jìn)行制備，經(jīng)過相應(yīng)的修飾及生物功能化，能夠達(dá)到對生物大分子、細(xì)胞等生物靶標(biāo)的選擇性檢測、定位和其生物功能的調(diào)控。由于具有以上特點(diǎn)，核酸適配體在生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究和臨床診斷與治療方面顯示出巨大的應(yīng)用前景。 本文以重組的GST-FOXM1融合蛋白作為靶蛋白，GST蛋白作為反篩蛋白，以包含有77個(gè)堿基的隨機(jī)單鏈DNA寡核酸庫作為初始庫，經(jīng)過7輪篩選，獲得了1條與靶蛋白FOXM1高特異性與高親和力結(jié)合的單鏈DNA核酸適配體JX42，該適配體與FOXM1的解離常數(shù)Kd達(dá)到225nM。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)核酸適配體JX42在復(fù)雜體系中也可以特異性地識別FOXM1。因此利用該核酸適配體能夠高特異性、高親和性地結(jié)合FOXM1蛋白的這一特點(diǎn)，把此核酸適體發(fā)展為研究FOXM1的有力工具，并且可以發(fā)展成為一種用于研究與FOXM1相關(guān)的人類惡性腫瘤及其他疾病的靶向探針。
【關(guān)鍵詞】：核酸適配體 FOXM1 SELEX 特異性識別
【學(xué)位授予單位】：湖南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R3416
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-9
• 第1章 緒論9-23
• 1.1 核酸適配體簡介9
• 1.2 SELEX 技術(shù)及其基本原理9-11
• 1.3 核酸適配體的篩選方法11-15
• 1.3.1 基于毛細(xì)管電泳的 SELEX(CE-SELEX)12
• 1.3.2 硝酸纖維素膜作為分離介質(zhì)的篩選12
• 1.3.3 基于親和色譜和磁珠的篩選12-13
• 1.3.4 基于 FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorting)的體外篩選13-14
• 1.3.5 基于微流控芯片的篩選14-15
• 1.4 核酸適配體的特征以及在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用15-20
• 1.4.1 核酸適配體的特征15-16
• 1.4.2 核酸適配體在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用16-20
• 1.5 轉(zhuǎn)錄因子 FOXM1 概述20-21
• 1.6 本論文擬開展的研究工作21-23
• 第2章 GST-FOXM1 DBD 融合蛋白及 GST 蛋白的原核表達(dá)與純化23-34
• 2.1 前言23-24
• 2.2 實(shí)驗(yàn)儀器與材料24-26
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法26-31
• 2.3.1 pGEX-4T-1-FOXM1(220-355 aa)重組質(zhì)粒的鑒定26-28
• 2.3.2 GST-FOXM1DBD 融合蛋白與 GST 蛋白的表達(dá)、提取與純化28-31
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論31-33
• 2.4.1 重組質(zhì)粒 pGEX-4T-1- FOXM1(220-355 aa)的鑒定和轉(zhuǎn)化31-32
• 2.4.2 GST-FOXM1DBD 融合蛋白與 GST 蛋白的表達(dá)、提取與純化32-33
• 2.5 本章小結(jié)33-34
• 第3章 轉(zhuǎn)錄因子 FOXM1 DBD 核酸適配體的篩選34-43
• 3.1 前言34-35
• 3.2 實(shí)驗(yàn)儀器和材料35-36
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法36-39
• 3.3.1 FOXM1 DBD 蛋白核酸適配體的篩選36-38
• 3.3.2 熒光顯微鏡法檢測庫的富集情況38
• 3.3.3 連接、轉(zhuǎn)化、克隆和測序38-39
• 3.4 結(jié)果與討論39-42
• 3.4.1 篩選過程最佳循環(huán)數(shù)的確定39-40
• 3.4.2 富集情況的檢測40-41
• 3.4.3 克隆與測序結(jié)果41-42
• 3.5 本章小結(jié)42-43
• 第4章 核酸適配體 JX42 對轉(zhuǎn)錄因子 FOXM1 識別的初步研究43-52
• 4.1 前言43-44
• 4.2 實(shí)驗(yàn)儀器和材料44
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法44-48
• 4.3.1 適配體 JX42 與 FOXM1-DBD 結(jié)合親和力的考察44-46
• 4.3.2 適配體 JX42 與 FOXM1 結(jié)合特異性的考察46
• 4.3.3 231 細(xì)胞“免疫”熒光染色46-48
• 4.4 結(jié)果與討論48-50
• 4.4.1 適配體 JX42 與 GST-FOXM1-DBD 的解離平衡常數(shù)值的測定48
• 4.4.2 適配體 JX42 與純蛋白 GST-FOXM1-DBD 結(jié)合親和力和特異性檢測48-49
• 4.4.3 適配體 JX42 與細(xì)胞裂解物中 FOXM1 結(jié)合的親和力和特異性的檢測49
• 4.4.4 231 細(xì)胞“免疫”熒光染色49-50
• 4.5 本章小結(jié)50-52
• 結(jié)論與展望52-54
• 參考文獻(xiàn)54-60
• 附錄 A 攻讀學(xué)位期間所發(fā)表的學(xué)術(shù)論文60-61
• 致謝61

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本文編號：351709